Ảnh hưởng của kích thước nang trứng đến chất lượng trứng lợn nuôi thành thục in Vitro - Nguyễn Văn Lâm1

Nguyễn Văn Lâm và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 112(12)/2: 149 - 154 149 ẢNH HƯỞNG CỦA KÍCH THƯỚC NANG TRỨNG ĐẾN CHẤT LƯỢNG TRỨNG LỢN NUÔI THÀNH THỤC IN VITRO Nguyễn Văn Lâm1, Hứa Nguyệt Mai2*, Nguyễn Văn Hạnh1, Nguyễn Việt Linh1 1Viện Công nghệ sinh học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam 2Trường Đại học Khoa học - ĐH Thái Nguyên TÓM TẮT Trong nghiên cứu này, chúng tôi khảo sát tỷ lệ các nhóm nang có kích thước khác nhau có trên bề mặt buồng trứng lợn và đánh giá ảnh hưởng của kích thước nang trứng tới chất lượng trứng trong quá trình nuôi thành thục in vitro. Các nang trứng được chia thành 3 nhóm với kích thước dưới 2mm, từ 2-3mm và trên 3mm với tỷ lệ lần lượt là 60,8±3,1%; 26,1±2,0% và 13,1±2,5% (P< 0,05). Tỷ lệ trứng loại A ở nhóm nang trên 3 mm cao hơn so với nhóm nang 2-3mm (20,5±6,8% và 5,8±2,3%), (P<0,05) trong khi nhóm nang dưới 2mm không có trứng loại A. Trứng loại B ở hai nhóm nang từ 2- 3mm và trên 3mm có tỷ lệ tương đương nhau (63,1%±4,9 và 62,5±7,8%) còn ở nhóm nang dưới 2mm thấp hơn chỉ đạt 40,5±4,1% (P<0,05). Những trứng đủ tiêu chuẩn ở các nhóm nang được nuôi trong điều kiện 38,5 0C và 5% CO2. Kết quả cho thấy tỷ lệ trứng thành thục ở nhóm nang trên 3mm cao nhất 60,7±5.4%, nhóm nang từ 2-3mm và dưới 2mm có tỷ lệ thành thục thấp hơn (29,7±4,6% và 6,8±3,1%); (P<0,05). Kích thước nang trứng có ảnh hưởng đến tỷ lệ của từng loại trứng khi thu nhận và tỷ lệ trứng thành thục sau quá trình nuôi in vitro. Nang có kích thước trên 3mm cho kết quả cao nhất cả về số trứng tốt và tỷ lệ trứng thành thục sau quá trình nuôi. Từ khóa: Kích thước nang; Trứng lợn; Chất lượng; Nuôi thành thục. ĐẶT VẤN ĐỀ* Lợn là nguồn cung cấp thực phẩm chủ yếu cho con người. Lợn còn là đối tượng gần gũi với con người về mặt sinh lý học do đó lợn có tiềm năng trở thành nguồn nguyên liệu các loại nội tạng phục vụ cho y học thay thế. Vì vậy, lợn được quan tâm nghiên cứu đặc biệt trên phôi. Việc sản xuất phôi lợn in vitro làm nguyên liệu cho các nghiên cứu đó hiện tại vẫn chưa đạt hiệu quả tương đương với các loài khác. Một trong những nguyên nhân của hạn chế này là sự thành thục chưa đầy đủ của các trứng lợn nuôi in vitro. Đã có rất nhiều nghiên cứu nhằm nâng cao chất lượng trứng lợn thành thục in vitro. Leibfried và đồng tác giả đã nghiên cứu dựa vào trạng thái bên ngoài của trứng như độ dày của lớp tế bào cận noãn bao quanh noãn bào trứng để chọn ra trứng có đủ chất lượng nuôi thành thục [8]. Trứng có lớp tế bào cận noãn dày, tơi thì tỷ lệ thành thục tốt hơn [10]. Trứng được nuôi trong môi trường có bổ sung thêm hormone FSH có tỷ lệ ở giai đoạn MII * Tel: 0973 113 541; Email: nguyetmaimai@gmail.com cao hơn so với khi được nuôi trong môi trường không có FSH (lần lượt là 86,7 và 58,0%) [4]. Mùa vụ cũng có ảnh hưởng tới chất lượng trứng lợn, khi thu trứng ở mùa xuân có tỷ lệ thành thục thấp hơn khi trứng thu ở mùa hè (lần lượt là 58,0 và 66,1%). Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng môi trường có bổ sung dịch nang trứng (pFF) sẽ kích thích trứng thành thục [12]. Qian và đồng tác giả đã khảo sát ảnh hưởng của kích thước nang đến chất lượng thành thục trong ống nghiệm. Kết quả cho thấy trứng thu ở nang trên 5mm có chất lượng thành thục và khả năng phát triển sau thụ tinh đến giai đoạn 6-8 tế bào cao hơn hẳn so với trứng được thu ở nang 2-2,9mm (90,5% với 67,4%) và (34,5% với 7,7%) [12]. Ở Việt Nam, việc thí nghiệm nuôi thụ tinh ống nghiệm (TTON) trứng lợn đã được tiến hành đầu những năm 2000 [3]. Tuy nhiên tỷ lệ trứng thành thục và hiệu suất tạo phôi vẫn còn thấp (tỷ lệ thành thục 14,8-18,3% [2]). Vì vậy việc nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng từ đó nâng cao sự thành thục của trứng cũng như hiệu suất TTON và tạo phôi ở đối tượng lợn là cần thiết nhằm có được một hệ thống sản Nguyễn Văn Lâm và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 112(12)/2: 149 - 154 150 xuất phôi hiệu quả và ổn định. Trong nghiên cứu này chúng tôi tìm hiểu ảnh hưởng của kích thước nang đến chất lượng trứng lợn thành thục in vitro. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu nghiên cứu Trứng lợn thu từ buồng trứng được lấy từ lò mổ trên địa bàn thành phố Hà Nội. Nội dung nghiên cứu Trên buồng trứng lợn chúng tôi chia ra làm ba nhóm nang có kích thước khác nhau: dưới 2mm; từ 2-3mm và trên 3mm. Nội dung 1: Khảo sát tỷ lệ các nhóm nang có mặt trên buồng trứng. Nội dung 2: Đánh giá ảnh hưởng của kích thước nang trứng tới chất lượng trứng mới thu. Nội dung 3: Đánh giá khả năng thành thục của trứng thu ở các nhóm nang sau 44 giờ nuôi. Phương pháp nghiên cứu Thu và phân loại trứng: Buồng trứng lợn sau khi thu ở lò mổ được bảo quản trong nhiệt độ từ 35-37 0C và vận chuyển ngay về phòng thí nghiệm. Tại đây buồng trứng được làm sạch và rửa lại nhiều lần trong dung dịch NaCl 9‰ trước khi tiến hành thu trứng, Ở thí nghiệm này chúng tôi tiến thu trứng bằng phương pháp hút nang: dùng xi lanh 10ml gắn với kim tiêm 20G chọc vào nang trứng và hút phần dịch nang có chứa trứng. Trứng được thu bằng kim thủy tinh có kích thước thích hợp và rửa lại 3-4 lần trong môi trường thu trứng và phân loại trứng theo phương pháp của Leibfried và First, 1979 [8]. Tất cả các giai đoạn được thực hiện trong điều kiện vô trùng và ở 37oC. Nuôi thành thục in vitro: Trứng sau khi được phân loại, đánh giá chất lượng sẽ được đưa vào môi trường nuôi thành thục theo phương pháp được mô tả trong nghiên cứu của Kikuchi và đồng tác giả, 2002 [6], [7]. Trong thí nghiệm này chúng tôi chỉ nuôi và đánh giá chất lượng thành thục các trứng loại A và B. Từng nhóm 40-50 trứng được nuôi trong 0,5ml môi trường MAT-I (môi trường NCSU- 37 có bổ sung các hormone PMSG và hCG, cùng với dbcAMP) và trong đĩa nuôi tế bào 4 giếng, trong tủ ấm 38,5oC và 5% CO2, độ ẩm 95%. Sau 24 giờ trong môi trường MAT-I, trứng được chuyển sang môi trường MAT-II (môi trường NCSU-37 không bổ sung hormone và dbcAMP) nuôi tiếp trong 20 giờ. Sau đó trứng được tách sạch tế bào cận noãn và đánh giá tỷ lệ thành thục. Đánh giá sự thành thục của trứng: Được làm theo phương pháp của Leibfried và Frist, 1979 [8]. Trứng lợn sau khi nuôi thành thục được tách sạch lớp tế bào cận noãn bằng cách xử lý trong giọt men hyaluronidase và vi thao tác bằng các kim thủy tinh có đường kính đầu kim bằng với đường kính của trứng. Sau đó rửa lại 3 - 4 lần trong môi trường nuôi thành thục (MAT- II), quan sát và ghi nhận sự có mặt hoặc không có mặt của thể cực thứ nhất dưới kính hiển vi với độ phóng đại 40-100 lần. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Khảo sát tỷ lệ các nhóm nang trên buồng trứng Kết quả khảo sát tỷ lệ các nhóm nang trên buồng trứng được trình bày trong bảng 1. Bảng 1: Kết quả tỷ lệ các nhóm nang có mặt trên buồng trứng. Số buồng trứng Số nang trứng Nhóm nang trứng Dưới 2mm Từ 2-3mm Trên 3mm 31 1983 1205 (60,8±3,1) a 518 (26,1±2,0) b 260 (13,1±2,5) c TB số nang/BT 64±5,4 38,9 a±5,9 16,7b ±2,0 8,4c ±2,1 Thí nghiệm được lặp lại 6 lần. Ký hiệu a, b, c trên cùng một hàng thể hiện sự sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0,05) Nguyễn Văn Lâm và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 112(12)/2: 149 - 154 151 Bảng 2: Kết quả phân loại chất lượng trứng Kích thước nang (mm) Số trứng thu được Phân loại chất lượng trứng Trứng A (% ± SEM) Trứng B (% ± SEM) Trứng C (% ± SEM) Dưới 2 825 0 (0)a 334 (40,5±4,0)a 491 (59,5±4,7)a Từ 2-3 860 50 (5,8±2,3)b 543 (63,1±4,9)b 267 (31,1±5,3)b Trên 3 626 128 (20,5±6,8)c 391 (62,5±7,8)b 107 (17,1±1,9)c Thí nghiệm được lặp lại 7 lần. Kí hiệu a, b, c trên cùng một cột thể hiện sự sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0,05). Tổng số nang của 31 buồng trứng là 1983 nang, trung bình số nang trên mỗi buồng trứng khảo sát là 64 nang/buồng trứng; nhóm nang có kích thước dưới 2mm có trung bình nang/buồng trứng cao nhất 38,9 chiếm 60,8%; nhóm nang có kích thước trên 3mm có trung bình nang/buồng trứng thấp nhất là 8,4 chỉ chiếm 13,1% và nhóm từ 2-3mm có trung bình nang/buồng trứng là 16,7 chiếm 26,1%. Kết quả này khá phù hợp với kết quả khảo sát của Ratky và đồng tác giả [10] khi khảo sát 60 buồng trứng lợn kết quả thu được, số nang trên bề mặt mỗi buồng trứng đạt từ 60-90 nang, trong đó số nang có kích thước ≥2 mm là 24,8 nang/buồng trứng. Như vậy có thể thấy không có sự sai khác về số lượng nang trứng và tỷ lệ các nang với kích thước khác nhau giữa nghiên cứu của chúng tôi với nghiên cứu của Ratky và đồng tác giả [10], về các chỉ tiêu trên của cùng một giống lợn ở hai địa điểm nghiên cứu cách xa nhau về địa lý cũng như khí hậu. Ảnh hưởng của kích thước nang trứng đến chất lượng trứng mới thu: Theo tiêu chuẩn phân loại trứng của Leibfied và cộng sự (1979) [8]. Trứng A có từ 3 lớp tế bào cận noãn trở lên, bông tơi bao phủ đồng đều trên mặt tế bào trứng và noãn bào chất có độ đồng nhất cao về màu sắc; Trứng B có từ 2 đến 3 lớp tế bào cận noãn, độ bao phủ của các tế bào cận noãn và mức độ đồng nhất màu sắc của noãn bào chất không bằng trứng A, trứng C là trứng có hoặc không có lớp tế bào cận noãn, noãn bào chất không đồng nhất. Ứng dụng phương pháp phân loại của Leibfied và cộng sự (1979) [8], chúng tôi thu được kết quả chi tiết được thể hiện ở bảng 2. Trứng loại A ở nhóm nang trên 3mm có tỷ lệ cao hơn hẳn so với 2 nhóm còn lại từ 2-3mm và dưới 2mm lần lượt là (20,5±6,8%; 5,8±2,3 và 0%). Trứng loại B ở nhóm nang trên 3mm và từ 2-3mm có tỷ lệ tương đương nhau (62,5±7,8% và 63,1±4,9%). Trứng loại C được thu ở nhóm nang có kích thước dưới 2mm có tỷ lệ cao hơn hẳn so với nhóm nang có kích thước từ 2-3mm và trên 3mm lần lượt là (59,5±4,7%; 31,1±5,3% và 17,1±1,9%). Những kết quả trên cho thấy kích thước nang có ảnh hưởng rõ rệt tới chất lượng trứng lợn. So với kết quả của tác giả Nguyễn Thị Ước và cộng sự khi khảo sát trên 90 buồng trứng lợn thu được kết quả số lượng trứng loại A và B từ nang trên 2 mm là 79,83 ± 0,03% [4], thì kết quả của chúng tôi thấp hơn không đáng kể (74,8%). Điều đó cho thấy sự ổn định của hệ thống khi trứng được thu nhận và nuôi trong cùng mùa vụ. Khả năng thành thục của trứng thu từ các nhóm nang sau 44 giờ nuôi in vitro: Sau khi thu và phân loại trứng, tiến hành nuôi cấy trứng trong môi trường MAT-I (môi trường NCSU-37 có bổ sung các hormone PMSG và hCG, cùng với dbcAMP), trong đĩa nuôi tế bào 4 giếng, trong tủ ấm 38,5oC và 5% CO2, độ ẩm 95%. Kết quả được trình bày cụ thể ở bảng 3. Nguyễn Văn Lâm và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 112(12)/2: 149 - 154 152 Bảng 3: Đánh giá thành thục bằng phương pháp soi thể cực sau 44 giờ nuôi Kích thước nang Số trứng thí nghiệm Số trứng thành thục % Dưới 2 mm 192 13 (6,8±3,1)a Từ 2-3mm 175 52 (29,7±4,6)b Trên 3 mm 150 91 (60,8±530.4)c Thí nghiệm lặp lại 6 lần. Kí hiệu a, b, c trên cùng một cột thể hiện sự khác nhau có ý nghĩa với P<0,05 Kích thước nang có ảnh hưởng tới chất lượng và tỷ lệ thành thục của trứng lợn nuôi trong ống nghiệm. Tỷ lệ thành thục của trứng ở nhóm nang có kích thước trên 3mm (60,8%) cao hơn hai nhóm còn lại. Tuy nhiên so với mộ số nghiên cứu trên thế giới vẫn còn thấp hơn rất nhiều (86,7% [5] và 90,5% [12]). Sự kém thành thục khi nuôi trứng in vitro có thể do rất nhiều nguyên nhân, trong đó có điều kiện chăn nuôi ở nước ta với chế độ dinh dưỡng chưa hợp lý, thức ăn chứa nhiều chất kích thích tăng trọng, và độ tuổi giết mổ sớm hơn so với độ tuổi trưởng thành của con vật. Như vậy cần có những nghiên cứu sâu hơn nhằm cải tiến hệ thống IVM cho trứng lợn thu tại Việt Nam phục vụ cho tạo phôi bằng thụ tinh ống nghiệm (in vitro fertilization), kích thích mẫu sinh (parthenogenesis) hoặc nhân bản vô tính (cloning). KẾT LUẬN - Qua khảo sát chúng tôi rút ra kết luận: trứng lợn thu được từ nhóm nang có kích thước dưới 2mm chiếm tỷ lệ 60,8%; nhóm nang có kích thước trên 3mm chỉ chiếm tỷ lệ 13,1% và nhóm từ 2-3mm chiếm tỷ lệ là 26,1%. - Trứng lợn loại A ở nhóm nang trứng có kích thước trên 3mm có tỷ lệ cao nhất (20,5±6,8%); Trứng lợn loại B ở nhóm nang trứng có kích thước trên 3mm và từ 2-3mm có tỷ lệ tương đương nhau (62,5±7,8% và 63,1±4,9%). Trứng loại C ở nhóm nang trứng có kích thước dưới 2mm có tỷ lệ cao nhất (59,5±4,7%). Kết quả trên cho thấy kích thước nang trứng có ảnh hưởng rõ rệt tới chất lượng trứng lợn. - Trứng lợn thu được từ nang trứng có kích thước trên 3mm có tỷ lệ thành thục cao nhất là 60,8% khi nuôi in vitro. Chúng tôi đề nghị sử dụng các trứng thu từ nang trứng có kích thước trên 3mm để nâng cao hiệu suất tạo phôi. Hình 1. Tập hợp tế bào trứng thu được và phân loại trứng (A: Trứng A; B: trứng B; C: trứng C) Hình 2. Trứng xuất hiện thể cực thứ nhất Nguyễn Văn Lâm và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 112(12)/2: 149 - 154 153 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Nguyễn Thị Phương Hiền (2007), Nghiên cứu ảnh hưởng của mùa vụ lên kết quả nuôi thành thục một số động vật nuôi, Luận văn thạc sỹ Nông nghiệp. [2]. Huỳnh Thị Lệ Duyên, Phan Kim Ngọc, Hồ Huỳnh Thùy Dương, Nguyễn Quốc Đạt (2003), “Ứng dụng kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm trên heo”, Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc, Hà Nội, tr.639-642. [3]. Bùi Xuân Nguyên (2003), “Phát triển công nghệ phôi và tế bào phôi ở Việt Nam”, Kỷ yếu Viện Công nghệ sinh học, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tr. 411 - 417 [4]. Nguyễn Thị Ước, Nguyễn Việt Linh, Nguyễn Văn Hạnh, Quản Xuân Hữu, Đặng Nguyễn Quang Thành, Trần Thị Thơm, Nguyễn Thị Mến, Bùi Linh Chi, Nguyễn Trung Thành, Dương Đình Long, Nguyễn Khắc Tích, Phan Ngọc Minh, Bùi Xuân Nguyên (2008), “Nghiên cứu sản xuất phôi lợn mini nội địa bằng tổ hợp công nghệ ống nghiệm và nhân bản vô tính”, Tạp chí công nghệ sinh học, 6(4A), tr. 625-635. [5]. Schoevers E.J., Kidson A., Verhijden J.H.M., Bevers M.M. (2003), “Effect of follicle- stimulating hormone on nuclear and cytoplasmic maturation of sow oocytes in vitro”. Theriogenology., 59: 2017-2028. [6]. Kikuchi K., Onishi A., Kashiwasaki N., Iwamoto M., Noguchi J., Kaneko H., Akita T., Nagai T. (2002), “Successful piglet production after transfer of blastocyst produced by a modified invitro system”, Biol Reprod., 66: 1033-1041. [7]. Kikuchi K., Kashiwazaki N., Noguchi J., Shimada A., Takahashi R., Hirabayashi M., Shino M., Ueda M., Kaneko H. (1999), “Developmental competence, after transfer to recipients, of porcine matured, fertilized, and cultured in vitro”. Biol Reprod., 6:336-340. [8]. Leibfried L. and First N.L. (1979), “Characterization of bovine follocular oocytes and their ability invitro”. J. Anim. Sci.,48:76-86. [9]. Ni Wayan Kurniani Karja. (2008), “Nuclear Maturation of Porcine Oocytes in vitro: Effect ofthe Cumulus-Oocyte Complexes Quality”, Indonesian Journal of Biotechnology.,13 (2): 1078-1084. [10]. Ratky, Katiyar P.K., Raminder Singh. (2003), “Maturation of porcine oocytes in vitro and developmental competence of porcine oocytes”, Biology of reproduction., 11: 299-305. [11]. Tatemoto H., Sakurai N., Muto N.( 2000), “Protection of porcine oocytes against apoptoic cell death caused by oxidative stress during In vitro maturation: role of cumulus cells”, Biol Reprod.,63: 805-810. [12]. Yun Qian., Wei Qun Shi., Jia Tong Ding., Bi Qin Fan., Yutaka Fuku. (2001), “Effect of follicle size on Cumulus - Expansion, In vitro fertilization and development of porcine follicular oocytes”, Journal of Reproduction and Development., 47(3): 145 – 152. Lời cảm ơn: Các tác giả xin chân thành cảm ơn TS. Bùi Xuân Nguyên, TS. Nguyễn Thị Ước và các đồng nghiệp tại Phòng Công nghệ Phôi, Viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ thực hiện và đóng góp ý kiến. Nghiên cứu được tài trợ bởi đề tài NAFOSTED 106.16.141.09, chủ nhiệm đề tài TS. Bùi Xuân Nguyên. Nguyễn Văn Lâm và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 112(12)/2: 149 - 154 154 SUMMARY EFFECTS OF FOLLICLE SIZE ON OOCYTE QUALITY AFTER IN VITRO MATURATION Nguyen Van Lam1, Hua Nguyet Mai2*, Nguyen Van Hanh1, Nguyen Viet Linh1 1Institute of Biotechnology - Vietnam Academy of Science and Technology 2College of Science -TNU In this experiment, we examined the proportion of groups of different sized follicles on the surface of pig ovaries and evaluate the effects of follicle size to quality oocytes during in vitro culture. On ovaries, we are divided into 3 groups of different sized follicles under 2mm, 2-3mm and >3mm the results is (60.8 ± 3.1% and 26.1 ± 2.0% and 13.1 ± 2.5%, respectively) (P <0.05). The rate of grade A oocytes in groups of 3 mm follicles than group 2-3mm follicles (20.5 ± 6.8% and 5.8 ± 2.3%), while less than 2 mm without the oocyte capsule type A (0 %) (P <0.05). Oocytes grade B from group 2-3mm and >3mm similar rate (63.1 ± 4.9% and 62.5 ± 7.8%) is less than 2 mm follicles in the lower group was only 40,5 ± 4.1% (P <0.05). The oocytes in the group qualify conducted follicles cultured in 38.50C and 5% CO2 and 95% N. The results showed that the rate of oocyte maturation in the highest group 3mm is 60.7 ± 5,4% followed by group 2-3mm follicles for maturation rate is 29.7 ± 4.6% and less than 2 mm follicle group is 6.8 ± 3.1% (P <0.05). Follicle size affects the results obtained and the rate of oocyte maturation in vitro culture process. The follicles size >3 mm for best results both in terms of good oocytes and oocyte maturation rate after the in vitro maturation. Key words: Follicle size; Porcine oocyte; Quality; Maturation. Phản biện khoa học: TS. Nguyễn Thị Hải Yến – Trường Đại học Khoa học – ĐH Thái Nguyên * Tel: 0973 113 541; Email: nguyetmaimai@gmail.com