Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên nuôi cấy đỉnh sinh trưởng và thiết lập cây hoàn chỉnh ở cây cọc rào (Jatropha curcas L.) - Đỗ Đăng Giáp

TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 188-195 188 ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG THỰC VẬT LÊN NUÔI CẤY ĐỈNH SINH TRƯỞNG VÀ THIẾT LẬP CÂY HOÀN CHỈNH Ở CÂY CỌC RÀO (Jatropha curcas L.) Đỗ Đăng Giáp1*, Nguyễn Thị Kim Loan1, Trần Trọng Tuấn1, Trương Thị Trúc Hà1, Thái Xuân Du1, Bùi Văn Thế Vinh2, Nguyễn Đình Lâm3, Dương Tấn Nhựt4 (1)Viện Sinh học nhiệt đới, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, (*)dodanggiap@gmail.com (2)Đại học Kỹ thuật công nghệ tp. Hồ Chí Minh (3)Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam (4)Viện Sinh học Tây Nguyên TÓM TẮT: Cây cọc rào (Jatropha curcas L.) được xem là nguồn năng lượng sinh học tái sinh không cạnh tranh với các cây lương thực trên thế giới. Phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng sẽ có ích cho việc nhân giống đồng nhất và tạo cây sạch vi rút. Chồi cây cọc rào có chứa đỉnh sinh trưởng được chọn để khử trùng và đem nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung riêng rẽ các chất điều hòa sinh trưởng thực vật khác nhau sau: kinetin (N6-furfuryladenin) (0; 0,1; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg.l-1), BA (6-benzylaminopurine) (0; 0,1; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg.l-1), TDZ (thidiazuron) (0; 0,01; 0,05; 0,10; 0,50; 1,0 mg.l-1). Sự cảm ứng chồi ban đầu được thúc đẩy hiệu quả nhất trong môi trường MS có bổ sung 0,1 mg.l-1 TDZ. Ở nồng độ này, hơn 95% đỉnh sinh trưởng phát triển hình thành chồi, ở các chồi được tái sinh không có sự hình thành mô sẹo. Việc sử dụng TDZ kết hợp với GA3 không có ảnh hưởng tốt lên sự hình thành chồi từ đỉnh sinh trưởng cây cọc rào mà chỉ có tác dụng kéo dài mẫu cấy. Trạng thái môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng lên sự phát triển của đỉnh sinh trưởng, môi trường MS bán rắn có bổ sung 0,1 mg.l-1 TDZ sẽ thích hợp cho sự hình thành chồi. Sự hình thành rễ ở những chồi bất định có kết quả tốt trên môi trường MS có bổ sung 1,0 mg.l-1 IBA và 3,0 mg.l-1 thiamin. Từ khóa: Jatropha curcas, cytokinin, đỉnh sinh trưởng, nhân giống, TDZ MỞ ĐẦU Cây cọc rào (Jatropha curcas L.) thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae), hay còn được gọi là cây dầu mè (tên tiếng Anh: Physic nut). Cây có nguồn gốc từ Mê-xi-cô, Trung Mỹ, sau đó được lan truyền sang châu Phi, châu Á. Cây Cọc rào có tên trong từ điển những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam [8]. Cây có thể sinh trưởng ở những vùng đất cát khô hạn. Hạt cây cọc rào có hàm lượng dầu khoảng 30-40%, dầu thô từ hạt được chế biến thành dầu diesel sinh học (biodiesel) và nhiều sản phẩm giá trị khác như phân hữu cơ, thuốc trừ sâu sinh học, dược liệu... Hiện nay, nhiều nước trên thế giới đang chạy đua phát triển cây này, nhất là các nước Ấn Độ, Trung Quốc, Thái Lan, Malaisia, Indonesia, Philippin, Mianma và nhiều nước châu Phi nhằm phục vụ nhu cầu năng lượng tại chỗ và xuất khẩu. Trồng cây cọc rào chống được sa mạc hóa, mang lại việc làm cho người nghèo, có ý nghĩa kinh tế-môi trường-xã hội cao. Trồng cây để khai thác dầu lâu năm thì phương pháp nhân giống bằng hạt được sử dụng nhiều hơn. Những nghiên cứu đã chỉ ra rằng, cây tạo thành từ nhân giống bằng giâm cành có đời sống ngắn hơn, khả năng chống hạn và bệnh tật kém hơn cây nhân giống bằng hạt [11]. Nhược điểm của phương pháp nhân giống bằng hạt là chất lượng cây con không đồng nhất, bởi vì cây cọc rào là cây thụ phấn chéo nên giữa các hạt có sự khác nhau về mặt di truyền, các cây tạo ra bằng gieo hạt có hàm lượng dầu trong hạt không ổn định, dao động từ 4 đến 40% [13]. Vì vậy, phương pháp nhân giống in vitro vẫn là kỹ thuật hiệu quả để nhân nhanh những cây đầu dòng. Vi nhân giống cây J. curcas đã được nghiên cứu nhiều trên thế giớí, cây con được tái sinh từ nuôi cấy các bộ phận khác nhau như: chồi nách, chồi đỉnh, đốt thân, trụ dưới lá mầm, cuống lá, lá... [31, 27, 32, 6, 14, 30]. Để sản xuất hiệu quả biodiesel từ cây cọc rào, điều quan trọng là cần có giống tốt và nhân những cây đầu dòng để phát triển vùng nguyên liệu [31, 27]. Phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng đã được sử dụng rộng rãi trong vi nhân giống thực vật bậc cao trong suốt ba thập kỷ qua. Do Dang Giap et al. 189 Ứng dụng quan trọng nhất của nuôi cấy đỉnh sinh trưởng là tạo ra các cây con sạch bệnh, nhân nhanh và bảo quản các phôi mầm sạch vi rút trong thời gian dài thông qua kỹ thuật bảo quản phôi đông lạnh [26]. Kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng được ghi nhận là có thể dòng hóa những giống cây trồng từ ex vitro vào điều kiện in vitro có đặc điểm sạch nhiều bệnh thực vật khác nhau như: vi rút, vi khuẩn, nấm bệnh [16, 15, 23, 10, 3]. Những hiệu quả của kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng đã được ứng dụng trong dòng hóa cây giống sạch bệnh ở một số loại cây trồng có giá trị như: khoai tây [4], tỏi [5], đậu lạc [21], củ cải đường [2] và cà chua [1]. Trong bài báo này, chúng tôi sử dụng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng cây Cọc rào để tạo nguồn cây giống cây cọc rào đầu dòng sạch bệnh. Kết quả nghiên cứu này sẽ giúp ích nhiều trong thiết lập quy trình nhân giống, giúp sản xuất cây với số lượng lớn trong thời gian ngắn. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu Sử dụng các chồi có chứa đỉnh sinh trưởng của cây cọc rào đầu dòng được trồng tại vườn ươm Viện Sinh học nhiệt đới làm vật liệu nuôi cấy. Các chồi sau khi thu nhận được khử trùng sơ bộ bằng cách đặt dưới vòi nước chảy (30 phút), rửa qua bằng xà phòng loãng, sau đó ngâm trong cồn 70% (30 giây). Mẫu được chuyển vào tủ cấy và lắc khử trùng với dung dịch javel ở nồng độ 12,5% với thời gian là 5 phút, sau đó rửa lại bằng nước cất vô trùng (4-5 lần), dùng kính lúp tách lấy đỉnh sinh trưởng để sử dụng cho các thí nghiệm. Phương pháp Khảo sát ảnh hưởng của cytokinin (BA, kinetin) và TDZ lên sự phát triển của đỉnh sinh trưởng cây cọc rào in vitro Các đỉnh sinh trưởng được cấy vào môi trường cơ bản MS (Murashige & Skoog, 1962) có bổ sung 30 g.l-1 sucrose; 8 g.l-1 agar và các chất điều hòa sinh trưởng gồm kinetin (0; 0,1; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg.l-1); BA 0; 0,1; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg.l-1); TDZ (0; 0,01; 0,05; 0,10; 0,50; 1,0 mg.l-1) ở các nồng độ riêng rẽ. Khảo sát ảnh hưởng sự kết hợp của TDZ và GA3 (gibberellic acid) lên sự phát triển của đỉnh sinh trưởng cây cọc rào in vitro Các đỉnh sinh trưởng được cấy vào môi trường MS có bổ sung 30 g.l-1 sucrose; 8 g.l-1 agar; 0,1 mg.l-1 TDZ kết hợp với GA3 ở các nồng độ khác nhau (0; 1,0; 3,0; 5,0; 7,0 mg.l-1). Khảo sát ảnh hưởng một số trạng thái môi trường nuôi cấy lên sự phát triển của đỉnh sinh trưởng cây cọc rào in vitro Các đỉnh sinh trưởng được cấy vào môi trường cơ bản MS có bổ sung 30 g.l-1 sucrose; 0,1 mg.l-1 TDZ và agar lần lượt là 0,0 g.l-1 (lỏng), 4,0 g.l-1 (bán rắn), 8,0 g.l-1 (rắn). Các thí nghiệm sau 4 tuần nuôi cấy ghi nhận các chỉ tiêu: tỷ lệ hình thành chồi, số chồi hình thành và khối lượng tươi mẫu. Khảo sát ảnh hưởng của thiamin lên sự hình thành rễ của các chồi từ đỉnh sinh trưởng cây cọc rào in vitro Các chồi hình thành từ đỉnh sinh trưởng được nuôi cấy trong môi trường MS có bổ sung 1 mg.l-1 IBA [8] kết hợp với vitamin B1 – thiamin (0; 1,0; 3,0; 6,0; 9,0 mg.l-1). Sau 3 tuần nuôi cấy ghi nhận các chỉ tiêu: số lượng rễ và chiều dài rễ. Tất cả môi trường được điều chỉnh về pH 5,8-5,9, hấp khử trùng ở 121°C, 1 atm trong 20 phút. Điều kiện thí nghiệm Thí nghiệm được tiến hành trong phòng nuôi cấy có nhiệt độ trung bình 25°C  2, thời gian chiếu sáng 14 h/ngày, cường độ chiếu sáng tương đương 50,64  1,00 µmol.m-2s-1, độ ẩm trung bình 60%  5. Xử lý thống kê số liệu Các thí nghiệm đều được bố trí theo kiểu thí nghiệm hoàn toàn ngẫu nhiên. Số liệu được ghi nhận và xử lý bằng phần mềm Statgraphics Centurion XV theo phương pháp DMRT [8] ở mức ý nghĩa 5%. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Ảnh hưởng của cytokinin (BA, kinetin) và TDZ lên sự phát triển của đỉnh sinh trưởng cây cọc rào in vitro Sự phát triển của đỉnh sinh trưởng trên môi TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 188-195 190 trường có bổ sung BA, kinetin và TDZ được thể hiện trong bảng 1. Các chất điều hòa sinh trưởng ở những nồng độ khác nhau có ảnh hưởng khác nhau đến sự hình thành chồi từ đỉnh sinh trưởng của cây Cọc rào. Sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường có bổ sung kinetin, BA, TDZ, đỉnh sinh trưởng có sự phát triển, các chồi mới được hình thành với tỷ lệ tái sinh chồi, số chồi hình thành và khối lượng tươi của chồi cao. Trên môi trường có bổ sung 1,0 mg.l-1 kinetin cho tỷ lệ mẫu hình thành chồi cao hơn (86,67%) so với những công thức còn lại, tuy nhiên, số chồi hình thành (8,67) lại thấp hơn so với môi trường có bổ sung 0,5 mg.l-1 kinetin (9,67), sự khác biệt giữa các công thức không có ý nghĩa về mặt thống kê. Trên môi trường MS có bổ sung BA, sự hình thành chồi thấp hơn so với môi trường có bổ sung kinetin và TDZ. Bảng 1. Ảnh hưởng của BA, kinetin và TDZ lên sự phát triển của đỉnh sinh trưởng cây Cọc rào Công thức thí nghiệm Nồng độ CĐHSTTV (mg.l-1) Tỉ lệ mẫu hình thành chồi (%) Số chồi hình thành/mẫu (chồi) Khối lượng tươi (g) Kinetin 0,1 66,67ef 9,00e 0,0224de 0,5 80,00c 9,67d 0,0331cd 1,0 86,67bc 8,67e 0,0219de 1,5 83,33bc 7,30f 0,0193ef 2,0 66,67ef 7,00fg 0,0148ef BA 0,1 60,00f 7,00fg 0,0173ef 0,5 83,33bc 8,67e 0,0208e 1,0 70,00e 8,67e 0,0136f 1,5 60,00f 10,67cd 0,0090g 2,0 30,00g 5,00g 0,0095g TDZ 0,01 60,00f 11,66cd 0,0319d 0,05 93,33b 16,66b 0,0541c 0,1 96,66a 17,66a 0,0944a 0,5 76,67d 16,0b 0,0714b 1,0 23,30g 13,66d 0,0464cd a, b, c... thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa ở mức tin cậy P = 0,05 theo phương pháp Duncan. Ảnh hưởng của các nồng độ TDZ đến sự phát sinh chồi khá rõ rệt, môi trường có bổ sung TDZ ở các nồng độ từ 0,01 - 0,10 mg.l-1 đều khả năng cảm ứng tạo chồi in vitro, nồng độ TDZ tăng dần thì số chồi và khối lượng tươi của chồi cũng tăng. Ở công thức có bổ sung 0,10 mg.l-1 TDZ, tỷ lệ hình thành chồi đạt gần tối đa (96,66%), số chồi và khối lượng tươi trung bình cũng cao nhất (17,66 chồi/mẫu và 0,0944 g/chồi). Tuy nhiên, khi tăng nồng độ từ 0,5 - 1,0 mg.l-1 TDZ thì khả năng tạo chồi và khối lượng tươi giảm dần có thể do sự ức chế của chất điều hòa sinh trưởng lên sự phát triển của đỉnh sinh trưởng. Do đó, có thể thấy môi trường nuôi cấy có bổ sung 0,1 mg.l-1 TDZ thích hợp cho sự phát triển của đỉnh sinh trưởng cây cọc rào. TDZ được sử dụng trong vi nhân giống thông qua con đường phát sinh cơ quan và phát sinh phôi trên nhiều đối tượng thực vật khác nhau [18]. Trong các báo cáo gần đây, TDZ là một phần không thể thiếu trong nuôi cấy mô các cây thân gỗ cũng như cây thân thảo [12]. Ảnh hưởng kết hợp giữa TDZ với GA3 lên sự phát triển của đỉnh cọc rào in vitro TDZ có thể kích thích cảm ứng và nhân chồi khi được sử dụng riêng rẽ hoặc kết hợp với các chất điều hòa khác. Trên cở sở đó, chúng tôi tiến hành thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của TDZ kết hợp với GA3 lên sự tăng trưởng của đỉnh sinh trưởng cây Cọc rào. Kết quả thu được sau 4 tuần được trình bày trong bảng 2. Do Dang Giap et al. 191 Bảng 2. Ảnh hưởng của TDZ và GA3 lên sự phát triển của đỉnh sinh trưởng cây cọc rào Công thức TDZ (mg.l - 1) GA3 (mg.l -1) Tỉ lệ mẫu hình thành chồi (%) Số chồi hình thành/mẫu (chồi) Khối lượng tươi (g) ĐC 0,1 0,0 100,00a 15,67a 0,0818a G1 0,1 1,0 83,00a 10,67b 0,0284ab G2 0,1 3,0 73,33ab 7,67b 0,0242ab G3 0,1 5,0 60,00c 6,00ab 0,0242ab G4 0,1 7,0 56,67c 5,00c 0,0178b Khi tiến hành cấy mẫu đỉnh sinh trưởng lên môi trường có bổ sung 0,1 mg.l-1 TDZ với GA3 ở các nồng độ khác nhau, chúng tôi nhận thấy, trên môi trường đối chứng 0,1 mg.l-1 TDZ không có bổ sung GA3 có tỷ lệ hình thành chồi, số lượng chồi hình thành và khối lượng tươi trung bình của chồi đạt cao nhất. Các công thức còn lại số mẫu được cảm ứng để hình thành chồi tương đối thấp. Trong nuôi cấy in vitro, GA3 có tác dụng kéo dài thân, kích thích các chồi, mầm ngủ trên cây. Gibberellin có tác động đối với nhiều đỉnh sinh trưởng, nếu thiếu gibberellin đỉnh sinh trưởng thể hiện một dạng hình cầu, tạo nên các mắt cây. GA3 đã được xác định là rất có hiệu quả trong việc ngăn chặn những sự phân chia vô tổ chức có thể dẫn tới sự hình thành mô sẹo, đồng thời nó kích thích và đẩy mạnh sự biệt hóa của đỉnh sinh trưởng [23]. Theo kết quả nhận được, chúng tôi thấy rằng, GA3 kết hợp với TDZ không có ảnh hưởng tốt lên sự hình thành chồi từ đỉnh sinh trưởng cây cọc rào mà chỉ có tác dụng kéo dài mẫu cấy. Ảnh hưởng một số trạng thái môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của đỉnh sinh trưởng cây cọc rào in vitro Sự phát triển của đỉnh sinh trưởng trên các môi trường rắn, bán rắn và lỏng được thể hiện trong bảng 3. Bảng 3. Ảnh hưởng của một số trạng thái môi trường nuôi cấy lên sự phát triển của đỉnh sinh trưởng cây cọc rào Trạng thái môi trường Tỉ lệ mẫu hình thành chồi (%) Số chồi hình thành/mẫu (chồi) Khối lượng tươi (g) Rắn 92,3b 7,00b 0,0939 b Bán rắn 100a 8,67a 0,1729 a Lỏng 51,6c 5,33c 0,0315 c Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, sự thay đổi về trạng thái vật lý của môi trường nuôi cấy cũng có tác động lên sự thay đổi của mẫu cấy. Kết quả ở bảng 3 cho thấy, ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy (môi trường lỏng, bán rắn, rắn) khá rõ nét lên sự tăng trưởng của đỉnh sinh trưởng. Trên môi trường MS ở điều kiện bán rắn, các đỉnh sinh trưởng phát triển hoàn chỉnh nhất, tỷ lệ hình thành chồi, số chồi hình thành và khối lượng tươi là cao nhất sau 4 tuần nuôi cấy. Trên môi trường lỏng, đỉnh sinh trưởng bị chết hoặc chồi hình thành yếu ớt, thân và lá bị mọng nước. Các chồi hình thành trên môi trường rắn tuy có tỷ lệ hình thành chồi, số lượng chồi và khối lượng tươi tương đối cao, nhưng khó áp dụng việc nhân giống trên môi trường rắn vào nhân giống thương mại, bởi vì tốn nhiều chi phí mua agar sẽ làm tăng giá thành của cây giống. Hiện nay, hầu hết các loài thực vật được nhân giống thương mại trên môi trường bán rắn đều thông qua con đường phát sinh cơ quan. Khi nuôi cấy mô hoặc tế bào thực vật trong môi trường lỏng ở trạng thái tĩnh và không thoáng khí, các mẫu không sinh trưởng, phát triển hoặc có hiện tượng thủy tinh thể ở chồi và lá, cây con TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 188-195 192 sẽ dễ bị chết khi đưa ra ngoài vườn ươm [24]. Như vậy, môi trường MS bổ sung 0,1 mg.l-1 TDZ ở điều kiện bán rắn là thích hợp cho nuôi cấy đỉnh sinh trưởng cây cọc rào (hình 1a, 1b, 1c, 1d). Ảnh hưởng của thiamin lên sự hình thành rễ của các chồi từ đỉnh sinh trưởng cây cọc rào Tất cả các tế bào được nuôi cấy đều có khả năng tổng hợp tất cả các loại vitamin cơ bản nhưng thường là với số lượng dưới mức yêu cầu. Để mô có sức sinh trưởng tốt phải bổ sung thêm vào môi trường một hay nhiều loại vitamin. Các vitamin là rất cần thiết cho các phản ứng sinh hoá. Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau. Thiamin là một vitamin căn bản cần thiết cho sự tăng trưởng của tất cả các tế bào. Các chồi non được nuôi cấy trên môi trường có bổ sung IBA kết hợp với thiamin đều bắt đầu cảm ứng hình thành rễ bất định sau 3 tuần nuôi cấy. Kết quả nghiên cứu được ghi nhận ở bảng 4. Bảng 4. Ảnh hưởng của kết hợp 1,0 mg.l-1 IBA và thiamin lên sự hình thành rễ của chồi tái sinh sau 3 tuần nuôi cấy Công thức Nồng độ thiamin (mg.l-1) Số rễ Chiều dài rễ (cm) IT0 0,0 0,758c 2,351c IT1 1,0 1,342a 3,528b IT2 3,0 1,517a 3,987a IT3 6,0 1,568a 3,859ab IT4 9,0 1,034b 3,196b Việc bổ sung thiamin vào môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng rõ rệt lên sự hình thành và phát triển rễ của chồi cây Cọc rào in vitro. Khi tăng nồng độ thiamin thì số lượng rễ và chiều dài rễ trung bình cũng tăng lên. Theo nghiên cứu của Thái Xuân Du và nnk. (2010) [8] đã ghi nhận môi trường MS kết hợp với 1,0 mg.l-1 IBA thích hợp cho sự hình thành rễ từ chồi tái sinh thông qua nuôi cấy lớp mỏng tế bào lá của cấy cọc rào. Kết quả thí nghiệm của chúng tôi cho thấy, trên môi trường có bổ sung 1,0 mg.l-1 IBA kết hợp với 3,0 mg.l-1 hoặc 6,0 mg.l-1 thiamin, số lượng rễ và chiều dài rễ trung bình đạt cao hơn so với công thức đối chứng không có bổ sung thiamin (hình 1e). Dhillon et al. (2009) [7] đã công bố những ảnh hưởng tích cực của thiamin lên sự hình thành rễ từ cành giâm cây Cọc rào. Linsmaier & Skoog (1965) [17] đã khẳng định thiamin cần thiết cho cho sự sinh trưởng của cây sau khi nghiên cứu kỹ lưỡng về sự có mặt của nó trong môi trường MS. . Hình 1. Hình thái nuôi cấy đỉnh sinh trưởng theo thời gian trên môi trường bán lỏng có bổ sung 0,1 mg.l-1 TDZ a. 3 ngày tuổi; b. 7 ngày tuổi; c. 14 ngày tuổi; d. 21 ngày tuổi; e. Cây hoàn chỉnh sau 60 ngày. Do Dang Giap et al. 193 KẾT LUẬN Các đỉnh sinh trưởng của cây cọc rào được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0,1 mg.l-1 TDZ ở điều kiện bán rắn, có sự tăng trưởng tốt nhất sau 4 tuần nuôi cấy. Sử dụng môi trường MS có bổ sung 0,1 mg.l-1 TDZ kết hợp với GA3, không cho kết quả tốt hơn cho sự tăng trưởng của đỉnh sinh trưởng. Sự hình thành rễ ở những chồi bất định có kết quả tốt trên môi trường MS có bổ sung 1,0 mg.l-1 IBA kết hợp với 3,0 mg.l-1 thiamin. Lời cảm ơn: Nhóm tác giả xin chân thành cảm ơn Phòng thí nghiệm trọng điểm Quốc gia về Công nghệ tế bào thực vật (Viện Sinh học nhiệt đới) đã hỗ trợ kinh phí cho nghiên cứu này. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Alam M. F., Banu M. L. A., Swaraz A. M., Parvez S., Hossain M., Khalekuzzaman M. and Ahsan N., 2004. Production of virus free seeds using meristem culture in tomato plant under tropical conditions. J. Plant Biotechnol., 6: 221-227. 2. Balamuralikrishnan M., Doraisamy S., Ganapathy T. and Viswanathan R., 2002. Combined effect of chemotherapy and meristem culture on sugarcane mosaic virus elimination in sugarcane. Sugar Tech., 4: 19-25. 3. Bhojwani S. S. and Razdan M. K., 1996. Plant Tissue Culture: Theory and Practice. A Revised Edition, Elsevier Press, New York, 510. 4. Bittner H., Schenk G., Schuster G. and Kluge S., 1989. Elimination by chemotherapy of potato virus S from potato plants grown in vitro. Potato Res., 32: 175-179. 5. Conci V. C. and Nome S. F., 1991. Virus free garlic (Allium sativum L.) plants obtained by thermotherapy and meristem tip culture. J. Phytopathol., 132: 186-192. 6. Datta M. M., Mukherjee P., Ghosh B. and Jha T. B., 2007. In vitro clonal propagation of biodiesel plant. Curr. Sci., 93: 1438- 1442. 7. Dhillon R. S., Hooda M. S., Pundeer J. S., Ahlawat K. S. and Kumari S., 2009. Development of efficient techniques for clonal multiplication of Jatropha curcas L., a potential biodiesel plant. Curr. Sci., 96(6): 823-826. 8. Thái Xuân Du, Đỗ Đăng Giáp, Nguyễn Thị Ngọc Hân, Bùi Văn Thế Vinh, Nguyễn Du Sanh, Dương Tấn Nhựt, 2010. Vi nhân giống cây cọc rào (Jatropha curcas L.) bằng kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng tế bào. Tạp chí Công nghệ Sinh học, 8(3B): 1287- 1291. 9. Duncan D. B., 1955. Multiple range and multiple F tests. Biometrics, 11(1): 1-5. 10. Grout B. W., 1999. Meristem tip culture for propagation and virus elimination. Methods in Molecular Biology, 111: 115- 125. 11. Heller J. 1996. Physic nut, Jatropha curcas L. International Plant Genetic Resource Institute: 1-66. 12. Huetteman C. A. and Preece J. E., 1993. Thidiazuron: a potent cytokinin for woody plant tissue culture. Plant Cell Tiss. Org., 33: 105-119. 13. Jha T. B., Mukherjee P. and Datta M. M., 2007. Somatic embryogenesis in Jatropha curcas L., an important biofuel plant. Plant Biotech. Rep., 1: 135-140. 14. Kalimuthu K., Paulsamy S., Senthilkumar R. and Sathya M., 2007. In vitro propagation of the biodiesel plant Jatropha curcas L. Plant Tis. Cult. Biotech., 17(2): 137-147. 15. Kartha K. K., 1984. Elimination of viruses. In: Vasil, IK (eds.). Cell culture and somatic cell genetics of plants. V-I, Laboratory procedure and their applications, Academic Press Inc, Orlando, 577-585. 16. La Motte C. E. and Lersten N. R., 1972. Attempts to obtain bacteria-free plants of Psychotria punctata (Rubiaceae): growth and root formation in callus cultures. Am. J. Bot., 59: 89-96. TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 188-195 194 17. Linsmaier F. M. and Skoog F., 1965. Organic growth factor requirements of tobacco tissue culture. Physiol. Plant, l8: 100-127. 18. Đỗ Tất Lợi, 1997. Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. Nxb. Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. 19. Malik K. A. and Saxena P. K., 1992. Regeneration in Phaseolus vulgaris L.: High frequency induction of direct shoot formation in intact seedlings by N6 benzylaminopurine and thidiazuron. Planta, 186: 384-389. 20. Morel G., 1964. A new means of clonal propagation of orchids. Am. Orchid Soc. Bull., 33: 473-478. 21. Morris J. B., Dunn S., Pinnow D. L., Hopkins M. S. and Pittman R. N., 1997. Meristem culture for virus elimination and peanut interspecific hybrid preservation. Crop Sci., 37: 591-594. 22. Murashige T. and Skoog F., 1962. A revised medium for a rapid growth and biossay with tobacco tissue culture. Physiol. Plant, 15: 473-497. 23. Dương Tấn Nhựt, 2007. Công nghệ sinh học thực vật, Tập 1. Nxb. Nông Nghiệp, Hà Nội. 24. Dương Tấn Nhựt, 2010. Một số phương pháp, hệ thống mới trong nghiên cứu công nghệ sinh học thực vật. Nxb. Nông Nghiệp, Hà Nội. 25. Pierik R. L. M., 1989. In vitro culture of higher plants. Dordrecht, The Netherlands: Martinus Nijhoff Publishers: 1-344. 26. Quak F., 1977. Meristem culture and virus- free plants. In: J. Reinert and Y.P.S. Bajaj (eds.). Applied and fundamental aspects of plant cells, tissue, and organ culture. Springer, Berlin, 598-615. 27. Rajore S. and Batra A., 2005. Efficient plant regeneration via shoot tip explant in Jatropha curcas L. J. Plant Biochem. Biotech., 14: 73-75. 28. Sardana J., Batra A. and Ali D. J., 1998. In vitro plantlet formation and micropropagation of Jatropha curcas L. Adv. Plant Sci., 11(2): 167-169. 29. Sarika S. and Meenakshi B., 2008. In vitro clonal propagation of physic nut (Jatropha curcas L.): Influence of additives. Int. J. Integr. Biol., 3(1): 73-75. 30. Singh A., Reddy M. P., Chikara J. and Singh S., 2010. A simple regeneration protocol from stem explants of Jatropha curcas. Ind. Crop Prod., 31: 209-213. 31. Sujatha M. and Mukta N., 1996. Morphogenesis and plant regeneration from tissue cultures of Jatropha curcas. Plant Cell Tiss. Org., 44: 135-141. 32. Sujatha M., Makkar H. P. S. and Becker K., 2005. Shoot bud proliferation from axillary nodes and leaf sections of non- toxic Jatropha curcas L. Plant Growth Regul., 47: 83-90. Do Dang Giap et al. 195 EFFECTS OF GROWTH REGULATORS ON PLANT TO MERISTEM CULTURE AND SET UP TO COMPLETE PLANT IN PHYSIC NUT PLANT (Jatropha curcas L.) Do Dang Giap1*, Nguyen Thi Kim Loan1, Tran Trong Tuan1, Truong Thi Truc Ha1, Thai Xuan Du1, Bui Van The Vinh2, Nguyen Đinh Lam3, Duong Tan Nhut4 1Institute of Tropical Biology, VAST 2HCMC University of Technology 3Insitute of Agricultural Science for Southern VietNam, VAST 4Tay Nguyen Institute of Biology, VAST SUMMARY Physic nut plant (Jatropha curcas L.) is considered as a potential source for a non-edible biofuel- producing energy crop throughout the world. This optimized meristem culture technique would be useful for developing uniform and virus-free clones of physic nut plant. Physic nut plant shoot apical meristems with 2 leaf primordia were aseptically isolated to sterilize and culture on Murashige and Skoog (MS) medium supplemented with kinetin (0; 0.1; 0.5; 1.0; 1.5; 2.0 mg.l-1), BA (0; 0.1; 0.5; 1.0; 1.5; 2.0 mg.l-1), TDZ (0; 0.01; 0.05; 0.10; 0.50; 1.0 mg.l-1) individually. Primary shoot induction was most effectively promoted by MS medium supplemented with 0.1 mg.l-1 TDZ. In this concentration, more than 95% of the shoots were regenerated without intervening any callus formation. The use of TDZ in combination with GA3 did not have good effects on the formation of shoots from meristem, in that only long meristems resulted. Also, when surveying the state of culture medium, that semi-liquid MS medium supplemented with 0.1 mg.l-1 TDZ will be suitable for the development of meristems. Rooting of adventitious shoots was achieved on MS medium supplemented with 1.0 mg.l-1 IBA and 3.0 mg.l-1 thiamin. Keywords: Jatropha curcas, cytokinin, micropropagation, meristem, TDZ. Ngày nhận bài: 21-6-2012