Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu

MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU Lý do chọn đề tài……………………………………………………...2 Mục tiêu nghiên cứu……………………………………………….….4 Nhiệm vụ nghiên cứu…………………………………………………4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu…………………………………….4 Ý nghĩa thực tiễn………………………………………………………4 NỘI DUNG Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Khái quát về cây đậu tương……………………………………………6 Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu môi trường đến sự sinh trưởng của thực vật……………………………………………………………9 Tình hình nghiên cứu khả năng chống chịu của cây đậu tương với điều kiện áp suất thẩm thấu cao………………………………………10 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu…………………………………………………17 Phương pháp nghiên…………………………………………………..17 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến sự nảy mầm của đậu tương DT02 và DT84………………………………………………………………..22 Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến hàm lượng prolin trong mầm đậu tương DT02 và DT84………………………………………28 Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến một số enzyme trong mầm đậu tương DT02 và DT84…………………………………………. ..30 KẾT LUẬN………………………………………………………….………40 TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………….……..41 MỞ ĐẦU Lý do chọn đề tài Đậu tương là giống cây trồng phổ biến ở nước ta và trên thế giới. Ở nước ta đậu tương là cây lương thực được sử dụng phổ biến cho cả người và vật nuôi. Có rất nhiều giống đậu tương là giống có năng suất cao được sử dụng phổ biến trên cả nước như: DT84, DT96, DT99 [3]. Thành phần dinh dưỡng của đậu tương rất phong phú, hàm lượng protein cao nên đậu tương được dùng chế biến thực phẩm giàu dinh dưỡng và đáp ứng nhu cầu của con người như: bột ngũ cốc, bột đậu, tương, giá đỗ... Cây đậu tương dễ trồng, có khả năng thích nghi tương đối rộng với các loại đất trồng nhờ khả năng cố định đạm của các vi khuẩn nốt sần cộng sinh trong rễ cây [24]. Ngoài ý nghĩa về mặt dinh dưỡng, kinh tế, đậu tương còn có tác dụng cao trong việc cải tạo đất , góp phần cắt đứt dây truyền sâu bệnh trong luân canh với cây trồng khác [18]. Việc tăng năng suất cây đậu tương mang lại nhiều lợi ích, tuy nhiên vấn đề cơ bản hạn chế năng suất đậu tương ở Việt Nam lại là điều kiện khí hậu, đặc biệt là hạn hán [4], [6], do nước ta có địa hình đa dạng, diễn biến khí hậu không ổn định, lượng mưa không đều giữa các vùng và các thời khì trong năm vì vậy hạn hán cũng có thể xảy ra ở bất kỳ vùng nào, mùa nào. Khi gặp điều kiện thiếu nước, năng suất của cây trồng bị giảm sút. Tuy vậy các cây sống ở vùng hạn có thể sinh trưởng tốt vì có khả năng thich nghi chống lại tác động xấu vì thiếu nước. Do đó việc nghiên cứu về các giống cây trồng chịu hạn được đặc biệt quan tâm. Ngày nay, các nghiên cứu về khả năng chịu hạn của cây trồng nói chung của đậu tương nói riêng ngày càng được mở rộng vì tính ứng dụng cao của cây trồng họ Đậu. Với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật các nhà khoa học có điều kiện tìm hiểu về cơ chế sinh lý, sinh hóa chịu hạn của thực vật như: sự ảnh hưởng của điều kiện thiếu nước đến sự phát triển của hạt [26], [30], cây non, đến quá trình quang hợp [24],[32] và hô hấp [27]. Các cơ chế sinh hóa và sinh học phân tử cũng đã được nghiên cứu như: xác định vị trí của gen liên quan đến điều chỉnh áp suất thẩm thấu, gen tổng hợp một số chất hình thành và tích lũy khi hạn hán như: prolin, nhóm amin bậc 4, một số đường…[14], [20], [30] Tuy vậy, để tìm hiểu rõ ảnh hưởng của hạn hán và bản chất khả năng chịu hạn của đậu tương cần có những nghiên cứu sâu hơn, đặc biệt là các nghiên cứu về sinh lý, sinh hóa của cây ở giai đoạn nảy mầm trong điều kiện gây hạn…Áp suất thẩm thấu chính là nguyên nhân gây sự chênh lệch giữa nồng độ trong và ngoài rễ cây làm cho cây không thể hút được muối khoáng và nước để nuôi cây. Cùng với sự ấm dần lên của trái đất, cây trồng cũng phải thích nghi với điều kiện môi trường. Cây trồng có sức chịu hạn tốt mới có thể tồn tại và nâng cao năng suất. Quỹ Nghiên cứu M.S. Swaminathan, đã bắt đầu công việc bảo tồn sự đa dạng nguồn gen giống cây trồng nông nghiệp nhằm đảm bảo nguồn cung lương thực bền vững bằng cách thành lập những ngân hàng hạt giống cộng đồng. Dự án đã khuyến khích trồng những loài cây thuốc đang bị khai thác quá mức tại các khu vườn cộng đồng, nhằm làm giảm sự phụ thuộc và phá huỷ rừng tự nhiên [34]. Đậu tương cũng là một trong những giống cây trồng được quan tâm đến vì tính ứng dụng rộng rãi và giá trị mà nó đem lại. Ngày nay sự biến đổi khí hậu ngày càng sâu sắc, việc nghiên cứu khả năng chống chịu của cây trồng cũng ngày càng trở nên cấp thiết. Chúng tôi nghiên cứu ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến đậu tương cũng chính là nghiên cứu khả năng chống chịu của hai giống đậu tương này. Dung dịch đường được sử dụng làm môi trường với các áp suất khác nhau. Mục tiêu nghiên cứu nhằm tìm hiểu tác động của áp suất thẩm thấu tới sự phát triển của đậu tương và đối với sự biến đổi hàm lượng axit amin prolin, sự biến đổi các chất dự trữ trong mầm như protein, lipit, tinh bột. Từ nhu cầu thực tế nêu trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “nghiên cứu ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến một số chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa của đậu tương DT02 và DT84” nhằm tìm hiểu sự biến đổi sâu sắc hơn về sinh lý, sinh hóa của đậu tương khi gặp điều kiện áp suất thẩm thấu khác nhau, kết quả này có thể làm cơ sở khoa học cho việc lựa chọn vùng sinh thái thích hợp để gieo trồng đậu tương. Trên thực tế giống đậu tương DT84 đã được chứng minh là giống chịu hạn và cũng được sử dụng khá rộng rãi còn giống đậu DT02 là giống đậu tương rau đang được trồng thử nghiệm ở 1 số địa phương với giá trị cao về năng suất và kinh tế. Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu sự ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa của đậu tương DT02 và DT84 Nhiệm vụ nghiên cứu Xác định chỉ tiêu sinh lý (khả năng nảy mầm, khối lượng tươi, khô của hạt mầm) Xác định chỉ tiêu sinh hóa (hàm lượng prolin, hoạt độ enzyme amylaza, enzyme proteaza và enzyme lipaza) Đối tượng và phạm vi nghiên cứu Đối tượng: giống đậu tương DT02 và DT84 Phạm vi nghiên cứu: giai đoạn nảy mầm của đậu tương DT02 và DT84 5. Ý nghĩa khoa học và ứng dụng - Bổ sung nguồn tư liệu về khả năng chống chịu của đậu tương ở Việt Nam. - Làm cơ sở khoa học để hoàn thiện quy trình thâm canh các giống đậu tương nhằm nâng cao năng suất, chất lượng đậu tương. - Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ góp phần bổ sung thêm các thông tin, các dữ liệu khoa học về cây đậu tương làm tài liệu tham khảo cho công tác giảng dạy, nghiên cứu khoa học và chỉ đạo sản xuất. NỘI DUNG Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Khái quát về cây đậu tương Nguồn gốc và lịch sử phát triển của đậu tương Đậu tương có tên khoa học là Glycine max (L) Merrill thuộc chi Glycine (L) họ Fabaceae bộ Fabales. Bộ Fabales là một trong những cây trồng cổ nhất của nhân loại, có nguồn gốc từ Mãn Châu (Trung Quốc) xuất phát từ một loài đậu nành dại thân mảnh, dạng dây leo có tên khoa học là Glycine soja Sieb và Zucc. Từ Trung Quốc cây đậu nành lan truyền dần ra khắp thế giới. Theo các nhà khoa học Nhật Bản vào khoảng 200 năm trước công nguyên đậu nành được đưa vào Triều Tiên và sau đó phát triển sang Nhật. Đến giữa thế kỷ XVII đậu nành mới được các nhà thực vật người Đức Engelbert Caemopfer đua về Châu Âu và đến năm 1954 đậu nành được du nhập vào Hoa Kỳ [1], [4], [16]và tới ngày nay chúng đã trở thành loài cây trồng phổ biến, là nguồn thức ăn của cả loài người và động vật. 1.1.2. Đặc điểm sinh trưởng và vai trò của đậu tương Đậu tương là cây trồng phổ biến, là cây nông nghiệp ngắn ngày điển hình, chúng rất nhạy cảm với ánh sáng và nhiệt độ. Nhiệt độ thích hợp cho đậu tương sinh trưởng là 20 – 300C, độ ẩm không khí là 81 – 85% và có các phản ứng đặc trưng khi gặp cường độ ánh sáng mạnh. Đậu tương có bộ rễ đặc biệt có khả năng hình thành các nốt sần để cố định đạm do có sự cộng sinh với các vi khuẩn Rhizobium có khả năng cố định nitơ từ không khí. Lá gồm lá đơn và lá kép, các chồi ở nách lá từ mặt thứ năm trở lên phát triển thành chồi hoa rồi chùm hoa. Quả sẽ phát triển sau một tuần từ khi hoa bắt đầu nở trên cây, rễ đậu tương lầ loại rễ chùm. Cây đậu tương sinh trưởng được trên nhiều loại đất khác nhau như: đất sét, đất thịt, thịt pha cát… và có khả năng cải tạo đất rất tốt. Ở nước ta, trong vòng 20 năm qua (1985 - 2005), diện tích, năng suất, sản lượng đậu tương đã không ngừng tăng lên. Đối với cây đậu tương diện tích tăng 99%, năng suất tăng 83,3% [35]. Vai trò của đậu tương là cây trồng tăng vụ cải tạo đất trồng. Thời gian sinh trưởng của đậu tương ngắn nên là cây trồng tăng vụ trong cơ cấu luân canh tăng vụ ở Trung du và Đồng bằng Sông Hồng. Cây đậu tương có khả năng phục hồi và duy trì độ phì nhiêu cho đất nhờ sự hoạt động của các vi khuẩn nốt sần đồng hóa nitơ từ không khí. Ngày nay có rất nhiều giống đậu tương được sử dụng hiệu quả trong sản xuất làm thực phẩm, là nguồn dinh dưỡng tốt. Đậu tương là một loại cây trồng đã có từ lâu đời được xem như là một loại “cây kỳ lạ”, là “vàng mọc trong đất”, là giống cây thần diệu, “cây đỗ thần”... Đậu tương là một loại nông sản có giá trị dinh dưỡng cao do trong thành phần có chứa nhiều protein và lipit. Từ lâu hạt đậu tương đã được các nước Châu Á và nhiều nước trên thế giới chế biến thành các sản phẩm dinh dưỡng cao như sữa đậu nành, tương, đậu phụ, xì dầu... Với sự phát trển của công nghệ tiên tiến, hàng loạt các sản phẩm cao cấp từ đậu tương đã trở lên quen thuộc. Đó là hỗn hợp thức ăn cho trẻ em, đồ ăn chay, kem cao cấp, bánh kẹo các loại... Protein trong đậu tương được coi là protein thực vật quan trọng nhất chiếm đến 70% tổng số protein dinh dưỡng trên toàn cầu trong khi protein có nguồn gốc động vật lại chỉ chiếm 30%. Ưu thế lớn nhất của đậu tương chính là giá thành rẻ, giá trị dinh dưỡng cao và có nhiều tính chất chức năng phù hợp với nhiều loại sản phẩm thực phẩm, các loại phụ phẩm của đậu tương có thể tận dụng cho chăn nuôi: thân, lá tươi cho trâu bò, bột nghiền từ thân,lá khô, vỏ quả, hạt lép và khô được dùng làm thức ăn cho gia súc. Trong y học cây đậu tương có ý nghĩa rất quan trọng chữa được một số bệnh như: tim mạch, chống ung thư, ngăn ngừa bệnh loãng xương của tuổi già[4], [1], [16]. 1.1.3. Tình hình sản xuất đậu tương Tình hình sản xuất cuẩ đậu tương trên thế giới đã tăng một cách đáng kể do nhu cầu sử dụng ngày càng tăng. Mỗi năm sản lượng đậu tương lại tăng lên. Hiện nay Mỹ vẫn là quốc gia có sản lượng đậu tương cao nhất trên thế giới, theo dự báo của Bộ Nông nghiệp Mỹ sản lượng đậu tương của nước này niên vụ 2010/2011 ước tính đạt 93,44. Bảng 1. Sản lượng đậu tương trên thế giới năm 2010 Stt Tên nước Sản lượng (triệu tấn) % so với tổng sản lượng toàn thế giới 1 Mỹ 93,44 36,8 2 Brazil 65 25,6 3 Achentina 50 19,7 4 Trung Quốc 14,6 5,7 5 Ấn Độ 8,8 3,5 6 Paraguay 6,5 2,6 7 Canada 3,9 1,5 8 Các nước khác 11,4 4,5 Đậu tương được trồng ở nước ta từ rất lâu nhưng diện tích còn bó hẹp trong một số tỉnh phía bắc như Cao Bằng, Sơn La... Trong những năm gần đây nhờ sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật và chính sách mở của nền kinh tế mà đậu tương đã được trồng phổ biến và rộng rãi khắp cả nước. Vùng Đồng bằng Sông Hồng và Đồng bằng sông Cửu Long là hai khu vực có sản lượng đậu tương cao nhất nước ta chiếm khoảng 60% sản lượng cả nước. Đặc biệt vùng Đồng bằng Sông Cửu Long chỉ chiếm khoảng 12% diện tích nhưng năng suất bình quân cao nhất cả nước đạt trên 20 ta/ha [3], [35]. Bảng 2. Sản lượng đậu tương ở Việt Nam năm 2001 – 2009 Năm Diện tích (nghìn ha) Năng suất (tấn/ha) Sản lượng (nghìn tấn) 2001 140,3 1,238 173,7 2002 158,6 1,327 205,6 2003 165,6 1,342 219,7 2004 183,8 1,338 245,9 2005 204,1 1,434 292,7 2006 185,6 1,390 258,1 2007 187,4 1,469 275,2 2008 192,1 1,393 267,6 2009 146,2 1,461 213,6 Nguốn Tổng cục thống kê [18]. Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu môi trường đến sự sinh trưởng của thực vật Thẩm thấu là quá trình vận chuyển dung môi qua một màng ngăn cách hai dung dịch có thành phần khác nhau khi không chịu tác động của các lực ngoài như là lực điện từ, lực pittông. Động lực của quá trình thẩm thấu là áp suất thẩm thấu. Áp suất thẩm thấu là sức hút của dung dịch hay lực hút nước, khả năng hút nước ở nhiệt độ không đổi phụ thuộc vào số lượng các hạt ở mỗi đơn vị thể tích dung dịch. Áp suất cần thiết để làm ngừng quá trình thẩm thấu là áp suất thẩm thấu (gọi tắt từ tiếng Anh: OP - osmotic pressure). Dung dịch có nồng độ càng cao thì áp suất thẩm thấu càng lớn [36]. Áp suất thẩm thấu của một dung dịch là giá trị để chỉ lượng nước có xu hướng đi vào trong dung dịch bởi sự thẩm thấu. Do đó dưới một điều kiện nhiệt độ và áp suất nhất định, nước sẽ di chuyển từ dung dịch có áp suất thẩm thấu thấp sang dung dịch có áp suất thẩm thấu cao. Mỗi dung dịch đều có một năng lượng tự do nhất định, dưới một điều kiện nhiệt độ và áp suất nhất định, năng lượng này có thể đo được và được gọi là thế năng thẩm thấu (osmotic potential). Nước tinh khiết có thế năng thẩm thấu bằng không. Vì thế năng thẩm thấu giảm khi nồng độ thẩm thấu tăng nên các dung dịch có thế năng nhỏ hơn không. Nước sẽ di chuyển từ vùng có thế năng thẩm thấu cao sang vùng có thế năng thẩm thấu thấp. Áp suất thẩm thấu giữ nước ở vị trí cân bằng. Thay đổi áp suất thẩm thấu làm thay đổi hàm lượng nước trong tế bào và gây ra rối loạn chức năng tế bào. Nhờ hiện tượng thẩm thấu rễ cây có thể hút nước vào. Nước từ đất vào lông hút rồi vào mạch gỗ của rễ theo cơ chế thẩm thấu, tức là từ nơi có áp suất thẩm thấu thấp đến nơi có áp suất thẩm thấu cao. Cây hấp thụ nước qua hệ thống rễ nhờ sự chênh lệch áp suất thẩm thấu (tăng dần từ đất đến mạch gỗ). Cây lấy được nước và chất khoáng từ đất khi nồng độ muối tan trong đất nhỏ hơn nồng độ dịch bào của rễ, tức áp suất thẩm thấu và sức hút nước của rễ cây phải lớn hơn áp suất thẩm thấu và sức hút nước của đất. Nếu áp suất thẩm thấu của đất tăng cao đến mức sức hút nước của đất vượt quá sức hút nước của rễ thì chẳng những cây không lấy được nước trong đất mà còn mất nước vào đất. Việc tăng áp suất thẩm thấu trong đất quá mức là nguyên nhân quan trọng nhất gây hại cho cây trồng trên đất mặn. Áp suất thẩm thấu có ảnh hưởng rất lớn đến đời sống của cây. 1.3. Tình hình nghiên cứu khả năng chống chịu của đậu tương 1.3.1. Tình hình nghiên cứu ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến sự sinh trưởng và phát triển của đậu tương Áp suất thẩm thấu có ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng và phát triển của đậu tương, áp suất thẩm thấu quá cao cây không lấy được nước đây cũng chính là nguyên nhân gây hạn cho cây. Quá trình sinh trưởng và phát triển của đậu tương cần rất nhiều nước, trong cả vụ nhu cầu nước của đậu tương dao động từ 330 – 766 mm nước. Nước trong cây không chỉ ảnh hưởng đến các phản ứng sinh hóa, các biến đổi chất trong tế bào mà còn có ảnh hưởng đến bộ máy quang hợp do nó là nguồn nguyên liệu và là điều kiện đặc biệt quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp các chất hữu cơ cần thiết cho cơ thể thực vật. Nhu cầu nước của đậu tương phụ thuộc vào thời gian sinh trưởng của cây, tốc độ phát triển của cây trước khi phủ kín đất và lượng nước có sẵn trong đất. Khả năng năng chịu hạn của các giống đậu tương là không giống nhau do chúng có các kiểu gen khác nhau. Khả năng này của các giống có liên quan đến sự phát triển nhanh của bộ rễ với tính chín sớm cũng như bản chất di truyền về khả năng sử dụng nước một cách tiết kiệm trong quá trình sinh trưởng và phát triển của cây. Cơ chế sinh học: áp suất thẩm thấu tăng cao gây hiện tượng mất nước được coi là môi trường hạn hán. Những giống đậu tương có khả năng chịu hạn tốt chống lại hoạc hạn chế sự mất nước bằng những biến đổi về hình thái hay những phản ứng hóa sinh phù hợp: Hình thái: bộ rễ khỏe là một điều kiện tăng tính chịu hạn của cây, các rễ phụ với bề mặt hút phát triển mạnh có khả năng giữ ẩm cho cây lâu hơn. Diện tích lá của đậu tương giảm khi gặp hạn là phản ứng nhằm giảm thiểu sự thoát hơi nước ở lá [27], [29]. Phản ứng đóng khí khổng khi gặp điều kiện hạn hán giúp ngăn chặn sự thoát hơi nước ra ngoài, sự đóng mở khí khổng liên quan đến rất nhiều quá trình như quang hợp, hô hấp, trao đổi ion, hấp thu dinh dưỡng… Phản ứng sinh hóa; các thay đổi hoá sinh thường liên quan đến cơ chế chịu mất nước nhằm sinh tổng hợp ra các chất bảo vệ hoặc nhanh chóng bù lại lượng nước đã mất. Điều chỉnh áp suất thẩm thấu nội bào thông qua sự tích lũy các protein và các axit amin như: prolin, fructan, ion K+, các enzyme thủy phân… là cơ chế giúp bảo vệ và duy trì lượng nước tối thiểu [31]. Các phản ứng sinh hoá bảo vệ cơ thể trong điều kiện mất nước bằng cách khử độc các sản phẩm tạo nên trong quá trình phân giải các hợp chất cao phân tử hoặc xúc tiến sự phục hồi các cấu trúc sinh học bị hư hại. Cơ chế phân tử: các nhóm gen và các chất có vai trò bảo vệ các phức hệ enzyme, các cấu trúc trong tế bào, đồng thời đào thải các chất bị biến tính có khả năng gây độc khi tế bào gặp yếu tố cực đoan. Những nhóm chất đặc biệt được quan tâm là protein sốc nhiệt (HSP – heat shock protein) trong đó có chất môi giới phân tử, ubiquitin, proteaza. Nhóm môi giới phân tử có vai trò rất quan trọng chúng tham gia vào việc tạo cấu trúc đúng cho protein bị biến tính do tác động của diều kiện môi trường bất lợi. Tăng hàm lượng protein LEA (protein được tổng hợp với số lượng lớn ở giai đoạn cuối của quá trình hình thành phôi) sẽ tham gia vào bảo vệ màng tế bào. Enzyme α-amylaza là enzyme xúc tác cho quá trình thủy phân tinh bột, glycogen, và các polixacarit tương tự. Chúng phân giải các liên kết 1, 4-glucozit ở giữa chuỗi mạch polixacarit tạo thành các đextrin phân tử thấp. Do đó dưới tác dụng của enzyme này dung dịch tinh bột nhanh chóng bị mất khả năng tạo màu với dung dịch iot và bị giảm độ nhớt mạnh. Enzyme α- amylaza tương đối bền với nhiệt nhưng kém bền với axit [12]. Trong điều kiện thuận lợi cho enzyme α - amylaza hoạt động mạnh thì quá trình phân giải tinh bột thành đường sẽ diễn ra mạnh tạo nhiều năng lượng cho hoạt động nảy mầm và sự phát triển của mầm và ngược lại trong điều kiện bất lợi cho enzyme α - amylaza hoạt động thì sự nảy mầm bị kìm hãm và mầm sinh trưởng, phát triển chậm. Prolin hay pirolidin cacboxylic là một amoniaxit ưa nước có công thức phân tử C5H9NO2. Trong phân tử prolin có chứa vòng pirolidin được tạo thành do sự kết hợp của nhóm amin bậc 1 với cacbon ở mạch bên. Prolin được tổng hợp từ glutamine. Quá trình này được kích thích bởi axit Absisic và stress [32]. Hiện nay con đường tổng hợp prolin đã được mô tả khá đầy đủ, nhưng sự phân giải prolin mới chỉ được hiểu biết rất ít [23]. Tỷ lệ prolin trong cây được điều khiển bởi enzyme P5CS (delta 1 – pyrrolin – 5 – cacboxylat synthetaza) và enzyme phân giải PDH (prolin dehydrogennaza) [16]. Prolin thuộc nhóm các chất điều hòa thẩm thấu, chúng có khối lượng phân tử nhỏ. Ngoài ra còn có nhóm hợp chất các amon bậc 4 (glyxinebetain, prolinbetain, beta – alaninbetain và choline – oxy – sunfat) và nhóm hợp chất 3 – dimethylsunfulfonio propionate (DMSP) cũng là nhóm có khả năng tạo áp suất thẩm thấu cao [12]. Nhóm hợp chất amin bậc 4 và DMSP đều là dẫn xuất của các tiền chất là axit amin. Các hợp chất trên cùng có chung tính chất không tích điện ở pH trung tính (như các ion vô cơ) và có khả năng tan tốt trong nước, không độc khi tập trung với nồng độ cao và làm ổn định cấu trúc các đại phân tử protein, giúp thành tế bào chống lại ảnh hưởng làm biến tính của sự tập trung muối cao và các chất hòa tan khác có hại cho tế bào [30]. Sự tích lũy các chất đó có ý nghĩa rất quan trọng, bởi vì chúng đóng vai trò nòng cốt trong việc duy trì sức trương của tế bào và hấp thụ nước ngược gradient nồng độ dưới tác động của stress. Như vậy, vai trò của prolin chống chịu stress ở thực vật thể hiện: prolin tham gia điều chỉnh áp suất thẩm thấu của nội bào và tham gia cấu trúc bảo vệ màng và protein. Khi nghiên cứu chức năng của prolin, biểu hiện hình thái và chống chịu áp suất thẩm thấu, Nanjo và cộng sự đã phát hiện: những cây bị đột biến về hình dạng (có sự bất thường về biểu bì, tế bào mô mềm và hệ mạch) có hàm lượng P5CS thấp, rất mẫn cảm với áp lực thẩm thấu. Nhưng những sự biến đổi đó có thể ức chế được bằng cách tăng cường hàm lượng prolin ngoại bào [5]. Nhiều kết quả nghiên cứu khác cũng cho thấy sự tích lũy prolin là một phản ứng thông thường của thực vật sống ở nơi có nồng độ muối cao (Stewort và Lee 1974; Treichel 1975; Briens và Larther 1982) và trong mô lá, mô phân sinh chồi của thực vật chịu áp lực nước (Barnet và Taylor 1996; Baggess 1976), trong vùng đỉnh của thực vật sống ở nơi có thế năng nước thấp (Voet Berg và Shorp 1991). Theo những cách thức khác nhau, những nghiên cứu ứng dụng công nghệ gen với tính chống chịu các điều kiện bất lợi về nước, đang tập trung vào nhóm gen thuộc chu trình tổng hợp prolin. Các gen này mã hóa cho enzyme P5CS và P5CR (gen tham gia vào quá trình tổng hợp prolin) đã được Kishor chuyển thành công vào thuốc lá và nhận kết quả tốt, lượng prolin tăng từ 8 – 10 lần so với cây đối chứng [30]. 1.3.2. Tình hình nghiên cứu tính chống chịu của đậu tương 1.3.2.1. Trên thế giới Việc nghiên cứu tính chịu mặn thực vật đã được nhiều nước trên thế giới nghiên cứu ở nhiều loại cây khác nhau, trong đó có đậu tương. Khi nói đến tính mặn chúng ta sẽ nghĩ ngay đến đất có hàm lượng muối cao, cây chết do nhiễm mặn lại chính là do chúng không hút được nước mặc dù môi trường đủ nước. Điều này cho thấy do nồng độ chất hòa tan trong đất quá cao (nói cách khác là do áp suất thẩm thấu quá lớn) làm cây không hút được nước dẫn đến hiện tượng hạn sinh lý. Hội Khoa Học Đất của Mỹ (SSSA 1979) đã xác định đất mặn là đất có độ dẫn điện (EC) lớn hơn 2 dS/m, không kể đến hai giá trị khác: tỉ lệ hấp thụ Sodium (SAR) và pH. Tuy nhiên, hầu hết các định nghĩa khác đều chấp nhận đất mặn là đất có độ dẫn điện EC cao hơn 4dS/m ở điều kiện nhiệt độ 250C, phần trăm Sodium trao đổi kém hơn 15, và pH nhỏ hơn 8,5 (US Salinity Laboratory Staff 1954). Các nghiên cứu cho thấy nhu cầu sử dụng nước của đậu tương cao, để tổng hợp 1kg chất khô cần khoảng 500 – 530 kg nước; để hạt nảy mầm hạt đậu tương phải có độ ẩm khoảng 50% [16]. Nhưng cây đủ nước vẫn có khả năng bị hạn nếu áp suất thẩm thấu của môi trường nuôi cấy quá lớn. Whitsitt và cộng sự (1997) đã nhận thấy rằng khi đậu tương bị mất nước trên 60% thì không thể phục hồi được. Mất nước thường kèm theo sự điều chỉnh áp suất thẩm thấu và tăng lượng mARN của gen dehydrin Mat 1. Đây là trường hợp dehydrin đặc biệt vì nó không cảm ứng với ABA, các gen cảm ứng với ABA được gọi là RAB (responsive to adscisic acid) hiện đang là nhóm gen được quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới. Nhiều nghiên cứu khẳng định có mối quan hệ giữa tích lũy ABA với sự tăng hàm lượng các chất điều chỉnh áp suất thẩm thấu khiu gặp hạn các chất này (thường là các protein hoặc axit amin ) được tổng hợp bởi các gen RBA. Bên cạnh đó, một số chất có khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu không liên quan đến sự tích lũy ABA, sự tăng hàm lượng của chúng độc lập với sự tích lũy ABA. 1.3.2.2. Ở Việt Nam Trong những năm qua có nhiều nghiên cứu về tính chống chịu của thực vật. Chẳng hạn: nghiên cứu đặc điểm di truyền và khả năng chịu hạn ở con lai đậu tương F1 [7], nghiên cứu mối quan hệ giữa tính chịu hạn với thành phần điện di protein của hạt đậu tương [9] nghiên cứu khả năng cộng sinh cố định đạm của một số dòng vi khuẩn ở đậu tương [8], khả năng chịu mặn và di truyền protein dự trữ của một số giống lúa trồng ven biển Đồng bằng Sông Cửu Long[19], cơ sở di truyền tính chống chịu với thiệt hại môi trường của một số cây lúa [2]. Kết quả nghiên cứu đã được ứng dụng trong sản xuất và chọn được nhiều dòng đậu tương cho năng suất và phẩm chất cao phù hợp với điều kiên khí hậu ở Việt Nam. Các nghiên cứu về huỳnh quang diệp lục, cường độ quang hợp cho phép đánh giá khả năng chịu hạn của cây [11], [15]. Cơ chế điều tiết áp suất thẩm thấu và quá trình nhận tín hiệu của stress do khô hạn, mặn, và lạnh tương đối giống nhau về nguyên tắc chung nhưng ở nước ta các công trình nghiên cứu chưa thật sâu sắc [2]. Các nghiên cứu về đậu tương trong những năm qua chủ yếu đi sâu về phương diện hình thái, di truyền, chọn giống, sinh học phân tử, một số nghiên cứu về sinh lý học, khả năng cộng sinh cố định đạm của một số dòng vi khuẩn ở đậu tương. Kết quả nghiên cứu đã được ứng dụng trong sản xuất tạo được nhiều giống mới có phẩm chất tốt năng suất cao. Những năm gần đây, nhờ vào sự trợ giúp của các thiết bị hiện đại, nhiều nghiên cứu sâu hơn về tính chịu hạn được tiến hành. Các nghiên cứu về huỳnh quang diệp lục, cường độ quang hợp cho phép đánh giá nhanh khả năng chịu hạn của cây [14]. Trong điều kiện bất lợi, khả năng chịu hạn của các giống thể hiện qua sự biến đổi các tham số F0, Fm và tỷ lệ Fv/m khi đo cường độ huỳnh quang diệp lục. Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu Đối tương nghiên cứu là giống đậu tương DT84, giống đậu đã được nghiên cứu và công nhận là giống có khả năng chịu hạn tôt và giống DT02 là giống đâu tương rau mới đang được trồng thử nghiệm và chưa được nghiên cứu sâu. Hai giống được lấy từ Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam. Đậu tương DT84: là giống được tạo ra bằng cách xử lý đột biến dòng 33 – 3 (tổ hợp lai DT80 x ĐH(D9T)) bằng tia gama C060/18 Kr. Được công nhận giống năm 1995. Hạt trung bình, màu vàng sáng, khối lượng 100 hạt đạt 150 – 160g. Năng suất trung bình đạt 13 – 18 tạ/ha. Thời gian sinh trưởng 85 – 95 ngày. Giống có khả năng chịu hạn khá. Đậu tương rau DT02: Là loại giống cây trồng thích ứng rộng, phù hợp với mọi chân đất, trồng được 3 vụ/năm. Thời gian trồng đến khi thu hoạch từ 82-100 ngày, năng suất hạt tươi 8-10 tấn/ha hạt khô 18-28 tạ/ha. Đậu tương DT02 có quả và hạt to gấp đôi so với đậu tương thường, là loại cây chịu nhiệt, chống chịu sâu bệnh tốt, có thể thu hạt non (Sử dụng tươi như rau), thu hạt khô làm giống hoặc chế biến các món đậu nành… . Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm Thí nghiệm được tiến hành tại Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu Khoa học và Chuyển giao Công nghệ - Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội 2 Chọn các hạt mẫu to, đều, có khả năng nảy mầm cao. Cần khoảng 500 hạt mỗi loại. Sử dụng buồng khí hậu nhân tạo, buồng vô trùng, khay đựng hạt giống… Tiến hành thí nghiệm gieo hạt trong dung dịch theo phương pháp của Volcova [32]. Khử trùng khay đựng, bình, ống nghiệm... bằng cồn 96. Giấy lọc được sấy ở 1300C trong một giờ, khử trùng hạt bằng dung dịch KMnO4 5% trong 5 phút. Dung dịch đường được pha bằng nước cất và đường saccarozo nguyên chất, có bổ sung kháng sinh nistatin 1 viên cho 1 lít dung dịch. Pha dịch đường ban đầu từ 1 atm – 13 atm, cứ cách 1 atm trồng thử nghiệm để xác định khoảng áp suất để nghiên cứu áp suất từ 1 atm – 9 atm. Sắp xếp mỗi giống vào 5 khay, mỗi khay chia 3 lô, mỗi lô 20 hạt, các khay sử dụng dịch đường ở các áp suất khác nhau. 2.2.2. Pha dung dịch Ptt = cRTi Ptt: áp suất thẩm thấu c: nồng độ đường (mol/l) R: 0,082 T: nhiệt độ tuyệt đối (K) T = (273+t 0C) i = 1: hệ số đẳng trương 2.2.3. Phương pháp xác định chỉ tiêu sinh lý Tỷ lệ nảy mầm (P) trong dung dịch đương saccaroz được tính theo công thức: H= Số lượng hạt nảy mầm trong dung dịch đường x100% Số lượng hạt nảy mầm trong nước cất Xác định khối lượng tươi khô của mầm bằng cân điện tử Sartorius 2.2.4. Phương pháp xác định chỉ tiêu sinh hóa a) Hoạt độ của enzyme proteaza Xác định bằng phương pháp chuẩn độ foocmon [13], [17] Hoá chất: dung dịch KH2PO4 0,1N, axit tricloaxetic 10% (CCl3COOH), dung dịch protein 5%, thuốc chỉ thị màu tymolphtalein hoặc phenolphtalein 1%, dịch lọc foocmaldehit, dung dịch NaOH 0,2N. Tiến hành: Lấy hai bình nón, cho vào mỗi bình 2g hạt đã nảy mầm nghiền nát, và 10ml KH2PO4 0,1N. Lắc nhẹ để tạo môi trường pH thích hợp với hoạt độ của proteaza có trong hạt đã nảy mầm. Thêm vào bình 1 (bình đối chứng) 10ml axit tricloaxetic 10% để kìm hãm hoạt động của enzyme. Cho vào mỗi bình 2ml dung dịch protein 5%. Đặt hai bình trong tủ ấm 370C, thời gian 1 giờ. Sau đó thêm vào bình 2 10ml axit tricloaxetic 10% để kìm hãm hoạt động của enzyme, kết thúc quá trình thuỷ phân protein. Dùng ống đong đo dung dịch mẫu (V), lọc dung dịch trong từng bình, đo lại dung tích dịch lọc, chuyển sang các bình tương ứng và thí nghiệm (bình2), và bình đối chứng (bình1). Thêm vào mỗi bình chứa dịch lọc 10ml foocmaldehit và 5 giọt tymolphtalein để làm chất chỉ thị màu. Chuẩn độ dung dịch bằng NaOH 0,2N đến khi xuất hiện màu xanh mực cửu long là được. Tính kết quả: X: hàm lượng nitơ amin trong mẫu nghiên cứu (mg), V1: số ml NaOH 0,2N chuẩn độ ở bình đối chứng, V2: số ml NaOH 0,2N chuẩn độ ở bình thí nghiệm, V3: số ml dung dịch lọc đem chuẩn độ, V: số ml dung dịch mẫu, g: khối lượng mẫu đem phân tích, f: hệ số điều chỉnh nồng độ NaOH 0,2N b) Hoạt độ enzyme lipaza [13] Hoá chất: Đệm axetat pH=4,7, cồn 96%, toluen, dung dịch NaOH 0,1N, Thuốc chỉ thị màu tymolphtalein hoặc phenolphtalein 1%. Tiến hành: Cân 5g hạt nghiền nhỏ thành dạng đồng thể chuyển vào bình nón 100ml cho thêm 10ml nước cất lắc đều. Cho thêm 1ml dầu lạc làm cơ chất và 5 ml dung dịch đệm axetat pH=4,7 với vài giọt toluen. Trộn đều hỗn hợp và cho vào tủ ấm 300C trong 20-24h. Bình kiểm tra phải đun sôi dịch enzyme 3-5phút để làm mất hoạt động của enzyme trước khi cho tiếp xúc với cơ chất. Sau khi ngừng phản ứng, cho vào mỗi bình 25ml cồn 96% và 15 -25ml ete, lắc đều, để lắng. Chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N và 0,5ml chỉ thị màu tymolphtalein 1%. Tính kết quả: X: hoạt độ của enzim lipaza, a: số ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ bình thí nghiệm, b: số ml NaOH dùng để chuẩn độ bình đối chứng, f: hệ số chỉnh lí NaOH 0,1N, w: khối lượng hạt. Hoạt độ enzyme - amilaza Xác định hoạt độ enzyme - amilaza bằng phương pháp của Rukhliadeva Gẻiacheva Hoá chất: dung dịch NaCl 0,1%, dung dich enzyme, tinh bột 1%, dung dịch Iot 0,02N. Tiến hành: chuẩn bị 10 ống nghiệm, cho vào mỗi ống 1ml dung dịch NaCl 0,1%. Thêm vào ống thứ nhất 1ml dung dịch enzyme lắc đều, lấy 1ml chuyển sang ống 2, lắc đều và chuyển 1ml sang ống 3, tiếp tục làm như vậy cho đến ống 10, lấy 1ml ông 10 bỏ đi. Cho vào mỗi ống 2ml dung dịch tinh bột 1%, lắc đều giữ ở 300C trong 30 phút. Sau đó lấy ra làm lạnh, cho vào mỗi ống một giọt dung dịch I2 0,02N. Ghi ống có độ pha loãng lớn nhất mà có khả năng phân giải tinh bột. Tính kết quả: X=2.2n X: hoạt độ của enzyme amylaz trong 1ml dung dịch enzyme n: ống nghiệm thứ n. Hàm lượng axitamin prolin Xác định theo phương pháp của Bates và cải tiến của Đinh Thị Phòng. Lấy mỗi mẫu 0,5g nghiền kỹ, thêm 10ml dung dịch sulfosalysilic, quay ly tâm 7000 vòng/phút trong thời gian 20 phút, lấy 2ml dịch chiết cho vào bình, thêm 2ml axit axetic và 2ml dung dịch nynhidrin, ủ trong nước nóng 1000C trong 1 giờ, sau đó ủ đá 5 phút. Sau đó bổ sung vào bình phản ứng 4ml toluen, lắc đều, lấy phần dung dịch màu hồng ở trên đem đo mật độ quang học ở bước sóng 520nm trên máy quang phổ tử ngoại khả kiến UV – 2450, Nhật Bản. Hàm lượng axit amin prolin được tính theo công thức: Y=1,4083xX+ 0,0140012 R2= 0,9991 (công thức được suy ra từ việc lập đường chuẩn prolin) YxV Px1000 A = (mg/g ) A: hàm lượng prolin (mg/g) Y: nồng độ prolin được tính bằng (mg/l) X: giá trị mật độ quang học được đo ở bước sóng 520nm. R2: là hệ số tương quan 2.2.5 Phương pháp xử lý số liệu Các kết quả nghiên cứu được đánh giá theo phương pháp toán thống kê sinh học qua các thông số: Giá trị trung bình mẫu (), độ lệch chuẩn (δ), sai số trung bình (m), Ftest và Ttest. Trung bình mẫu: Độ lệch chuẩn: Sai số trung bình: Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến sự nảy mầm của đậu tương DT02 và DT84 3.1.1. Tỉ lệ nảy mầm Nảy mầm là giai đoạn đầu tiên tạo cơ sở trong quá trình phát triển của cây, đây là quá trình sinh lý quan trọng trong chu kỳ sinh trưởng và phát triển của thực vật. Trong giai đoạn này cây rất mẫn cảm với sự thiếu nước chính vì vậy tại các áp suất khả năng nảy mầm của hạt cũng rất khác nhau. Bảng 3.1. Sự nảy mầm của hạt đậu tương DT02 và DT84 Đơn vị (%) Ptt ngày 1 ngày 2 ngày 3 DT84 DT02 DT84 DT02 DT84 DT02 1 6,67 11,67 20,00 33,33 36,67 48,33 3 6,67 5,00 15,00 20,00 23,33 41,67 5 - - 3,33 1,67 8,33 15,00 7 - - - - - 5,00 9 - - - - - - 11 - - - - - - 13 - - - - - - ngày 4 ngày 5 ngày 6 DT84 DT02 DT84 DT02 DT84 DT02 56,67 53,33 70,00 81,17 100,00 100,00 28,33 50,00 51,67 83,33 91,67 96,67 15,00 26,67 20,00 41,67 75,00 78,00 3,33 15,00 8,33 30,00 60,67 68,33 1,67 9,00 7,67 18,33 46,33 58,67 - - - - - - - - - - - - Quá trình nảy mầm của hạt được tính bắt đầu bằng sự hút nước và trương nước trong hạt, lượng nước thích hợp cho đậu tương nảy mầm là 50 – 60% khối lượng của hạt, khi gieo hạt trong áp suất thẩm thấu cao hạt sẽ bị cản trở sự hút nước và do đó các quá trình sinh lý, hóa sinh trong hạt bị ức chế và nảy mầm bị kìm hãm. Tỷ lệ nảy mầm cao hay thấp thể hiện khả năng thích ứng với điều kiện thiếu nước (điều kiện áp suất thẩm thấu cao) của hạt đậu tương. Áp suất thẩm thấu ảnh hưởng rất lớn đến khả năng nảy mầm của đậu tương, áp suất càng cao khả năng nảy mầm của đậu tương càng giảm, ở 11 và 13 atm đậu tương hoàn toàn không nảy mầm được. Theo nghiên cứu của Nguyễn Huy Hoàng (1992) [7] ta thấy đậu tương DT84 và DT02 đều là giống chịu hạn khá nhưng mức chịu hạn của DT02 tốt hơn DT84. Bảng 3.1 cho thấy ở 1atm thì đậu tương DT02 nảy mầm mạnh hơn đậu tương DT84 nhưng ở 3 atm thì khả năng nảy mầm của DT02 lại kém hơn DT84 nhưng kể từ những áp suất thẩm thấu cao hơn khả năng nảy mầm của DT02 đều cao hơn DT84. 3.1.2. Khối lượng tươi của mầm Khối lượng tươi của mầm đậu là kết quả của quá trình sinh trưởng, khối lượng tươi của đậu tương phụ thuộc nhiều vào lượng nước hút được từ môi trường. Chúng tôi tiến hành cân khối lượng tươi của hạt mầm và lá mầm đậu tương DT02 và DT84 ở ngày 2, 4, 6. Bảng 3.2. Khối lượng tươi của hạt đậu tương nảy mầm Đơn vị: gram Ptt ngày 2 ngày 4 ngày 6 DT84 DT02 DT84 DT02 DT84 DT02 1 0,540 ±0,040b 0,583 ±0,012b 0,556 ±0,017b 0,710 ±0,002d 0,756 ±0,020d 0,880 ±0,008e 3 0,520 ±0,005a 0,596 ±0,009b 0,656 ±0,080c 0,693 ±0,012d 0,710 ±0,024d 0,726 ±0,017d 5 0,530 ±0,016a 0,610 ±0,008c 0,603 ±0,030b 0,623 ±0,005c 0,690 ±0,029c 0,796 ±0,009e 7 0,530 ±0,040a 0,666 ±0,005c 0,606 ±0,005b 0,656 ±0,012c 0,726 ±0,020d 0,780 ±0,009e 9 0,420a ±0,005 0,676 ±0,005c 0,623 ±0,012c 0,676 ±0,009c 0,653 ±0,020c 0,760 ±0,012d Ghi chú: a, b, c, d, e thể hiện sự sai khác giữa DT02 và DT84 ở các áp suất thẩm thấu với độ tin cậy ≥ 95%. Hình 3.3 Khối lượng tươi của DT02 và DT84 dưới tác động của áp suất thẩm thấu (ngày 2) Hình 3.4. khối lượng tươi của hai giống DT02 và DT84 dưới tác động của áp suất thẩm thấu (ngày 4) Từ bảng 3.2 và đồ thị biểu diễn khối lượng tươi của hai giống ta thấy ngày thứ 2 khối lượng tươi của đậu tương DT84 có xu hướng giảm khi áp suất thẩm thấu tăng, điều này cho thấy trong những ngày đầu khả năng hút nước của đậu DT84 ở áp suất cao kém vì vậy khối lượng hạt mầm ở áp suất thẩm thấu cao sẽ nhỏ hơn khối lượng hạt mầm ở áp suất thẩm thấu thấp. Còn đậu DT02 khối lượng hạt mầm tăng theo chiều tăng áp suất thẩm thấu, do khả năng nảy mầm của DT02 tốt hơn DT84, ở những áp suất thẩm thấu thấp đậu tương DT02 đã nảy mầm lượng chất dự trữ trong hạt bị phân giải để nuôi mầm làm hạt mầm có khối lượng nhỏ hơn các hạt ở áp suất cao vì các hạt đều đã hút nước rất mạnh làm tăng khối lượng lên. Khối lượng tươi của hai giống tăng dần theo các ngày do lượng nước được sử dụng cho hạt mầm tăng lên. 3.1.3. Khối lượng khô Khối lượng khô của mầm đậu tương chính là khối lượng sau khi loại bỏ hết lượng nước trong mầm. Chúng tôi tiến hành cân khối lượng khô của mầm đậu tương sau khi sấy ở 1050C trong 3 giờ. Khối lượng khô được đo vào các ngày 2, 4, 6. Bảng 3.5. Khối lượng khô của hạt mầm đậu tương DT02 và DT84 Đơn vị: gram Ptt ngày 2 ngày 4 ngày 6 DT84 DT02 DT84 DT02 DT84 DT02 1 0,156 ±0,005a 0,256 ±0,009c 0,176 ±0,004a 0,310 ±0,005d 0,146 ±0,005a 0,303 ±0,005d 3 0,166 ±0,005a 0,256 ±0,005c 0,190 ±0,002b 0,332 ±0,008e 0,166 ±0,005a 0,297 ±0,005d 5 0,183 ±0,005b 0,256 ±0,009c 0,260 ±0,036c 0,300 ±0,008d 0,203 ±0,009b 0,286 ±0,009d 7 0,173 ±0,015a 0,276 ±0,005d 0,230 ±0,008c 0,323 ±0,005e 0,243 ±0,025c 0,326 ±0,005e 9 0,170 ±0,008a 0,200 6±0,008b 0,203 ±0,005b 0,330 ±0,008e 0,260 ±0,029d 0,346 ±0,009e Ghi chú: a, b, c, d, e thể hiện sự sai khác giữa hai giống với các áp suất khác nhau, độ tin cậy ≥ 95%. Hình 3.6. Khối lượng khô của DT02 và DT84 dưới tác động của áp suất thẩm thấu (ngày 2) Hình 3.7. Khối lượng khô của DT02 và DT84 dưới tác động của áp suất thẩm thấu (ngày 4) Khi áp suất thẩm thấu quá cao sẽ gây hiện tượng hạn sinh lý cho mầm đậu tương, tốc độ phân giải các chất dự trữ giảm, khối lượng khô vì thế cũng giảm chậm. Áp suất cao kìm hãm các quá trình trao đổi chất trong mầm đậu tương, quá trình phân giải các chất dự trữ chậm nên không đủ năng lượng và nguyên liệu sơ cấp cho quá trình tổng hợp các chất. Vì vậy song song với việc giảm khối lượng khô là sự sinh trưởng chậm của mầm đậu tương trong điều kiện áp suất cao. Từ 1 – 5 atm khối lượng khô của hai giống đều đạt cao nhất ở ngày thứ 4 sau đó giảm khi sang ngày thứ 6 do quá trình phân giải chất dự trữ diễn ra mạnh. Khối lượng khô của 2 giống đậu tương ở các áp suất cao có sự tăng lên qua các ngày bởi vì quá trình sinh trưởng của mầm đậu ở các áp suất cao diễn ra chậm, sự phân giải các chất dự trữ chưa cao, đến ngày thứ 4 hạt mới nảy mầm. 3.2. Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến hàm lượng prolin trong mầm đậu tương DT02 và DT84 Prolin là axit amin thuộc nhóm hợp chất amon bậc 4 phân tử nhỏ. Những hợp chất này đóng vai trò then chốt trong việc điều chỉnh áp suất thẩm thấu trong tế bào chất thực vật để phản ứng lai với điều kiện môi trường bất lợi [30], [35]. Vì vậy việc định lượng hàm lượng prolin được coi là phương pháp đánh giá khả năng chống chịu của cây. Chúng tôi tiến hành đo hàm lượng prolin vào các ngày thứ 2, 4, 6. Bảng 3.8. Hàm lượng prolin trong mầm đậu tương DT02 và DT84 Đơn vị mg/g Ptt ngày 2 ngày 4 Ngày 6 DT84 DT02 DT84 DT02 DT84 DT02 1 0,25±0,03a 0,59±0,06b 0,33±0,12a 0,91±0,12b 0,52±0,11a 1,16±0,15c 3 0,48±0,06a 0,70±0,07b 0,59±0,16b 1,05±0,14c 0,79±0,06b 1,36±0,06c 5 0,79±0,06b 1,04±0,07c 0,97±0,16b 1,55±0,28c 1,13±0,16c 2,02±0,08d 7 1,12±0,14c 2,03±0,29d 1,81±0,73d 2,37±0,18e 2,86±0,29e 2,89±0,19e 9 2,42±0,18e 3,21±0,17e 2,77±0,43e 3,63±0,16f 3,31±0,14e 3,86±0,12f Ghi chú: a, b, c, d, e, f thể hiện sự sai khác giữa hai giống đậu tương với độ tin cậy ≥ 95% Hình 3.9. Hàm lượng prolin ở giống đậu tương DT02 và DT84 dưới tác động của áp suất thẩm thấu (ngày 2) Hình 3.10. Hàm lượng prolin ở giống đậu tương DT02 và DT84 dưới tác động của áp suất thẩm thấu (ngày 4) Hình 3.11. Hàm lượng prolin ở giống đậu tương DT02 và DT84 dưới tác động của áp suất thẩm thấu (ngày 6) Từ bảng số liệu và đồ thị cho ta thấy hàm lượng prolin tăng lên theo thời gian và tăng theo chiều tăng của áp suất. Ở 9 atm hàm lượng prolin là cao nhất. Theo chiều tăng của các áp suất, hàm lượng prolin cũng tăng rất mạnh cho thấy trong điều kiện áp suất thẩm thấu cao đã làm tăng hàm lượng prolin để giúp tế bào chất điều chỉnh áp suất thẩm thấu nội bào thích nghi với điều kiện môi trường. Sự tăng cường tổng hợp prolin là một chỉ tiêu quan trọng để đánh giá khả năng chống chịu của cây khi gặp điều kiện hạn hán, stress, áp suất cao. Phản ứng này giúp cây duy trì áp lực thẩm thấu, cấu trúc thành tế bào và đảm bảo sự trao đổi nước khi cây sống ở môi trường bất lợi. Hàm lượng prolin của DT02 luôn cao hơn DT84, khi chuyển sang áp suất thẩm thấu cao, tốc độ tăng hàm lượng prolin của DT02 cũng nhanh hơn DT84. Điều này cho thấy khả năng chống chịu của DT02 khi gặp điều kiện áp suất cao tốt hơn DT84. 3.3. Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến một số enzym trong mầm đậu tương 3.3.1. Hoạt độ enzyme amylaza α - Amylaza là một hệ enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật. Các enzyme này thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử trong nhóm polysacarit với sự tham gia của nước. RR’ + H – OH -> RH + R’OH Trong quá trình động viên chất dự trữ trong hạt nảy mầm, nguyên liệu chủ được chuyển hóa sử dụng dễ dàng là tinh bột. Enzyme chủ yếu xúc tác chuyển hóa tinh bột thành đường cung cấp cho quá trình hô hấp và sinh trưởng của cây mầm khi chưa có lá và rễ hoàn thiện là α – amylaza. Ở đậu tương α - amylaza hoạt động rất mạnh ngay ở giai đoạn hình thành hạt[12]. Kết quả nghiên cứu hoạt độ của enzyme α - amylaza được chúng tôi tiến hành đo ở ngày 1, 3, 5 Bảng 3.12. Hoạt độ α - enzyme amylaza trong mầm đậu tương Đơn vị: UI/g ptt ngày 1 ngày 3 ngày 5 DT84 DT02 DT84 DT02 DT84 DT02 1 2,50±0,01a 2,61±0,03b 2,82±0,04b 2,86±0,04c 2,89±0,01c 3,15±0,04d 3 2,93±0,03c 3,07±0,12c 3,11±0,01c 3,38±0,10d 3,38±0,01d 3,55±0,05d 5 3,35±0.01d 3,17±0,17c 3,34±0,02d 3,62±0,05d 3,71±0,03e 3,86±0,07e 7 3,67±0,01d 3,35±0,09d 4,06±0,02e 4,21± 0,03f 4,14±0,05e 4,43±0,06f 9 2,85±0,02b 2,99±0,05c 2,47± 0,01a 2,97±0,05c 2,09±0,02a 2,84±0,05b Ghi chú: a, b, c, d, e, f thể hiện sự sai khác giữa hai giống với độ tin cậy ≥ 95% Hình 3.13. Hoạt độ α - enzyme amylaza ở mầm đậu tương DT02 và DT84 dưới tác động của áp suất thẩm thấu (ngày 1) Hình 3.14. Hoạt độ α - enzyme amylaza ở mầm đậu tương DT02 và DT84 dưới tác động của áp suất thẩm thấu (ngày 3) Hình 3.15. Hoạt độ α - enzyme amylaza ở mầm đậu tương DT02 và DT84 dưới tác động của áp suất thẩm thấu (ngày 5) Từ bảng và hình cho ta thấy hoạt độ enzyme α - amylaza ở mầm đậu tương DT02 và DT84 đều tăng theo chiều tăng của áp suất từ 1 – 7 atm, đến 9 atm thì giảm. Khi áp suất thẩm thấu tăng hoạt độ enzyme của mầm đậu tương cũng nhanh chóng tăng do sự phân giải tinh bột thành monosacarit làm tăng áp suất thẩm thấu trong tế bào chất, góp phần giúp hạt có thể lấy được nước trong môi trường có áp suất thẩm thấu cao. Tuy nhiên, ở 9 atm thì hoạt độ enzyme α - amylaza lại giảm do lượng nước hút vào quá ít không đủ cho quá trình phân giải tinh bột thành đường. Hoạt độ enzyme α - amylaza của DT02 cao hơn DT84 chứng tỏ khả năng thích nghi của đậu tương DT02 tốt hơn DT84. 3.3.2. Hoạt độ enzyme proteaza Proteaza là enzyme phân giải protein thành các sản phẩm có khối lượng phân tử nhỏ như axit amin, chuỗi polipeptit, đây là những nguyên liệu khởi đầu cho quá trình tổng hợp nên protein cấu trúc và các loại protein chức năng khác. Chất dự trữ chủ yếu trong hạt đậu tương là protein nên enzyme proteaza là enzyme hoạt động chủ đạo trong quá trình biến đổi hóa sinh của hạt nảy mầm tạo nguồn nguyên liệu cho hô hấp cung cấp năng lượng và chất trung gian cho quá trình tổng hợp chất cần thiết cho nảy mầm và cây con sinh trưởng. Hàm lượng protein trong mầm đậu tương cao nên sự phân giải protein diễn ra mạnh mẽ ngay ở pha thấm nước. Trong quá trình nảy mầm hoạt độ protein cũng tăng theo đồng thời lượng protein phân giải sẽ ngày càng nhiều cung cấp năng lượng và nguyên liệu sơ cấp cho mầm đậu tương tổng hợp các chất mới. Nếu hàm lượng protein cao điều này chứng tở khả năng phát triển của giống đạu tương đó hiệu quả. Ngoài ra những phân tích phân tử về protein của các giống đậu tương cho thấy sự đa dạng của các protein và các izozyme của chúng, có thể đây là nguyên nhân dẫn đến sự biến đổi rất khác nhau về hoạt độ proteaza ỏ các giống đậu tương, đồng thời cũng thể hiện khả năng chống chịu vốn có của các giống đậu tương là khác nhau. Chúng tôi tiến hành đo hoạt độ của enzyme proteaza ở các ngày 2, 4, 6 Bảng 3.16. Hoạt độ enzyme proteaza ở hai giống đậu tương DT02 và DT84 Đơn vị: mg/g Ptt ngày 2 ngày 4 ngày 6 DT84 DT02 DT84 DT02 DT84 DT02 1 1,80±0,06b 1,94±0,01b 1,63±0,05a 1,77±0,06b 2,53±0,06c 2,68±0,03c 3 2,59±0,12c 2,85±0,06d 2,14±0,21c 2,23±0,08c 2,64±0,06c 2,81±0,09d 5 2,95±0,05d 3,07±0,05e 3,07±0,03d 3,19±0,13e 3,07±0,04e 3,16±0,03d 7 3,04±0,12d 3,30±0,06e 3,19±0,03e 3,37±0,07f 3,32±0,03e 3,63±0,04f 9 1,26±0,11a 2,31±0,08c 1.22±0,10a 2,37±0,20c 1,71±0,05b 2,74±0,04d Ghi chú: a, b, c, d, e, f thể hiện sự sai khác giữa các giống đậu tương với độ tin cậy ≥ 95% Hình 3.17. Hoạt độ enzyme proteaza ở đậu tương DT02 và DT84 dưới tác động của áp suất thẩm thấu (ngày 2) Hình 3.18. Hoạt độ enzyme proteaza ở đậu tương DT02 và DT84 dưới tác động của áp suất thẩm thấu (ngày 4) Hình 3.19. Hoạt độ enzyme proteaza ở đậu tương DT02 và DT84 dưới tác động của áp suất thẩm thấu ( ngày 6) Từ bảng số liệu và đồ thi cho ta thấy hoạt độ của enyme proteaza tăng theo chiều tăng cuả áp suất thẩm thấu từ 1 – 7 atm nhưng đến 9 atm thì có xu hướng giảm mạnh. DT02 là giống có hoạt độ proteaza cao hơn DT84, ở 9 atm tuy hoạt độ có giảm nhưng vẫn ở giá trị khá cao, điều này chứng tỏ khả năng sinh trưởng trong điều kiện áp suất thẩm thấu cao của đậu tương rau DT02 tốt hơn giống DT84. Hoạt độ enzyme proteaza tăng dần qua các ngày. Ngoài ra, những phân tích phân tử về proteaza của các giống đậu tương cho thấy sự đa dạng của các protein và các izozyme của chúng. Có thể đây là nguyên nhân của sự biến đổi rất khác nhau về hoạt độ proteaza ở các giống đậu tương, đồng thời cũng thể hiện khả năng chống chịu vốn có của các giống đậu tương khác nhau là khac nhau. 3.3.3. Hoạt độ của enzyme lipaza Enzyme lipaza la enzyme phân giải lipit, trong hạt đậu tương có đến 20% là lipit, bởi vậy không chỉ là cây cung cấp protein, mà đậu tương còn là cây lấy dầu quan trọng, các sản phẩm dầu thực vật có nguồn gốc chủ yếu từ đậu tương [13]. Trong hạt đậu có chứa dầu, lipit dự trữ và triaxyl glyxerol được lưu trữ trong các cấu trúc chuyên hóa. Khi hạt nảy mầm các chất này được phân giải trong các glioxixom theo con đường β – oxi hóa đi vào con đường glioxilic, sản phẩm của quá trình này đi vào sự tổng hợp đường mới. Kết quả nghiên cứu về hoạt độ lipaza được đo ở các ngày thứ 1, 3, 5 được trình bày dưới bảng sau. Bảng 3.20. Hoạt độ enzyme lipaza của hai giống đậu tương DT02 và DT84 ở các áp suất thẩm thấu Đơn vị: UI ptt ngày 1 ngày 3 ngày 5 DT84 DT02 DT84 DY02 DT84 DT02 1 21,94±0,61b 24,23±0,78b 23,03±0,33b 23,09±0,45b 27,32±0,56c 20,42±0,19b 3 24,70±0,25b 25,31±0,81c 26,16±0,03c 26,76±0,53c 26,75±0,73c 27,34±0,21c 5 26,68±0,58c 28,30±0,65c 27,24±0,01c 27,47±0,64d 20,08±0,09b 21,70±0,22b 7 30,11±0,67e 31,36±0,72e 29,78±0,24d 30,44±0,33e 25,73±0,13b 27,58±0,18c 9 19,81±0,37b 20,47±0,43b 18,95±0,19a 19,98±0,38b 16,27±0,00a 19,07±0,65b Ghi chú: a, b, c, d, e thể hiện sự sai khac giữa các giống đậu tương với độ tin cậy ≥ 95% Hình 3.21. Hoạt độ enzyme lipaza của đậu tương DT02 và DT84 dưới tác động của áp suất thẩm thấu (ngày 1) Hình 3.22. Hoạt độ enzyme lipaza của đậu tương DT02 và DT84 dưới tác động của áp suất thẩm thấu (ngày 3) Hình 3.23. Hoạt độ enzyme lipaza của đậu tương DT02 và DT84 dưới tác động của áp suất thẩm thấu (ngày 5) Từ bảng số liệu cho chúng ta thấy hoạt độ của enzyme lipaza có xu hướng tăng dần theo sự tăng của các áp suất thẩm thấu từ 1 – 7 atm, riêng ngày thứ 5 hoạt độ enzyme lipaza lại giảm ở 5 atm. Điều này chứng tỏ những ngày đầu lượng lipit dự trữ trong mầm đậu đượng phân giải mạnh. Ở điều kiện áp suất thích hợp lượng lipit phân giải cũng vì thế mà cao hơn trong điều kiện áp suất cao. 9 atm không phải là áp suất thích hợp cho quá trình phân giải lipit của cả hai giống đậu tương. KẾT LUẬN Từ nghiên cứu về chỉ tiêu sinh lý sinh hóa của hai giống đậu tương: DT02, DT 84 trong điều kiện các áp suất thẩm thấu khác nhau chúng tôi rút ra một số kết luận sau. Ở các áp suất thẩm thấu khác nhau sự sinh trưởng của các giống đậu tương cũng không giống nhau, áp suất càng cao khả năng nảy mầm của các giống càng giảm, giống đậu tương DT02 có khả năng nảy mầm cao hơn DT84. Hàm lượng prolin gia tăng rõ rệt khi sinh trưởng trong điều kiện áp suất cao. Sự tích lũy hàm lượng prolin trong mầm giúp tăng khả năng thẩm thấu của tế bào, đảm bảo sự hút nước khi cây sống trong điều kiện thiếu nước. Hàm lượng prolin chính là chỉ tiêu quan trọng để đánh giá mức độ chịu hạn, chịu stress của các giống cây. Hàm lượng prolin tăng theo chiều tăng áp suất thẩm thấu, hàm lượng prolin trong đậu tương DT02 cao hơn hàm lượng có trong DT84. Hoạt độ của enzyme trong mầm đậu tương: áp suất thẩm thấu có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt độ của các enzyme phân giải các chất dự trữ trong mầm đậu tương. Enzyme α - amylaza, hoạt độ amylaza tăng dần theo chiều tăng áp suất thẩm thấu từ 1 – 7 atm. Hoạt độ enzyme amylaza của đậu tương DT02 cao hơn DT84. Hoạt độ của enzyme proteaza tăng dần theo chiều tăng của áp suất thẩm thấu nhưng khi áp suất thẩm thấu cao thì hoạt độ enzyme lại giảm. Ở đậu tương rau DT02 hoạt độ proteaz cao hơn ở DT84. Hoạt độ lipaza ngày thứ 5 có sự tăng giảm không đều. Giống DT02 có hoạt độ cao hơn giống DT84.