Nghiên cứu sử dụng tinh trùng đông lạnh từ mào tinh hoàn trong thụ tinh ống nghiệm ở lợn - Nguyễn Thị Hiệp

Nguyễn Thị Hiệp và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 123(09): 101 - 106 101 NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG TINH TRÙNG ĐÔNG LẠNH TỪ MÀO TINH HOÀN TRONG THỤ TINH ỐNG NGHIỆM Ở LỢN Nguyễn Thị Hiệp1, Nguyễn Thị Ước1, Hứa Nguyệt Mai2, Nguyễn Việt Linh1* 1Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam 2Trường Đại học Khoa học, Đại học Thái Nguyên TÓM TẮT Thụ tinh ống nghiệm (TTON) là kỹ thuật chủ yếu tạo phôi in vitro với mục đích phục vụ nghiên cứu y sinh và bảo tồn đa dạng sinh học ở lợn. Nguồn nguyên liệu chủ yếu trong các trường hợp này là tế bào trứng và tinh trùng ở dạng đông lạnh. Trong bài này chúng tôi trình bày nghiên cứu ảnh hưởng của các lô tinh đông lạnh tới kết quả thụ tinh ống nghiệm ở lợn. Kỹ thuật TTON và đông lạnh tinh được tiến hành theo phương pháp của Kikuchi và cộng sự (2002). Trứng lợn loại A, B (có trên 3 lớp tế bào cận noãn) được nuôi thành thục trong môi trường 199 bổ sung 10% FBS (huyết thanh thai bò) trước khi thụ tinh với tinh thu từ dịch hoàn của lợn Landrace, được xử lý và bảo quản trong nitơ lỏng. Các chỉ tiêu theo dõi trong các thí nghiệm là tỷ lệ hình thành tiền nhân đực, tỷ lệ đơn tinh trùng, tỷ lệ phân chia và phát triển của phôi. Kết quả kiểm tra tế bào trứng sau thụ tinh cho thấy tỷ lệ hình thành tiền nhân đực trong tế bào trứng được thụ tinh với các lô tinh TL1 và TL2 tương ứng là 75,31 ± 6,88% và 57,03 ± 6,83% (P>0,05), tỷ lệ đơn tinh trùng tương ứng là 40,84 ± 5,03% và 39,61 ± 3,7%. Tỷ lệ chia, tỷ lệ phôi dâu/ phôi nang cũng không có sự khác biệt giữa hai lô tinh, tương ứng là 51,49 ± 5,77% và 29,96 ± 7,26% đối với lô tinh TL1 và 52,99 ± 8,13% và 16,69 ± 4,31% đối với lô tinh TL2. Kết quả thí nghiệm cho thấy các lô tinh đông lạnh có thể sử dụng trong thụ tinh ống nghiệm ở lợn. Từ khóa: Thụ tinh ống nghiệm (TTON), tinh đông lạnh, lợn, tiền nhân đực, đơn tinh trùng, phôi dâu, phôi nang MỞ ĐẦU* Công nghệ chuyển gene ở phôi lợn là một trong những lĩnh vực đang được quan tâm nghiên cứu [1], [3]. Hơn nữa, sản phẩm phôi ống nghiệm là công cụ quan trọng trong việc nghiên cứu qui luật của sự thành thục và sự phát triển ở giai đoạn sớm ở lợn [3]. Các công nghệ này góp phần nâng cao hiệu quả chăn nuôi lợn thịt và cho phép thực hiện một số nghiên cứu ứng dụng y sinh mới như ghép mô khác loài ở người [6], [5], [10]. Khi trứng, phôi lợn dùng để thao tác chuyển gene được khai thác bằng phương pháp gây rụng trứng thông thường, giá thành công nghệ sẽ tăng cao do việc phải phẫu thuật nhiều con cho. Việc thiết lập thành công một hệ thống thụ tinh ống nghiệm chắc chắn với các sản phẩm phôi lợn bảo đảm chất lượng sẽ mang lại hiệu quả giảm giá thành và chủ động thời gian thao tác [5]. Hiện tượng thụ tinh đa tinh trùng xảy ra ở lợn nhiều hơn so với các loài động vật khác, ngay * Tel: 0949 492281, Email: nvlinh@ibt.ac.vn cả khi thụ tinh trong cơ thể dưới các điều kiện thực nghiệm đa dạng [11],[4]. Mặc dù các kỹ thuật về thành thục ống nghiệm, thụ tinh ống nghiệm ở lợn đã được cải thiện dần dần trong những năm gần đây, tỷ lệ đa tinh trùng cao ở lợn vẫn là một trong những tồn tại chính trong hệ thống thụ tinh ống nghiệm ở lợn [2]. Nguyên nhân cho hiện tượng này có thể bao gồm chất lượng tinh dịch ở thời điểm thụ tinh [10]. Với mục đích đánh giá khả năng sử dụng tinh trùng đông lạnh thu từ dịch hoàn của lợn đực giống đã trưởng thành để thụ tinh ống nghiệm, trong bài này chúng tôi trình bày kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các lô tinh đông lạnh - giải đông tới khả năng hình thành tiền nhân đực và sự phát triển tiếp theo của tế bào trứng lợn thành thục. VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP Thu trứng và nuôi thành thục in vitro Buồng trứng lợn được lấy ở lò mổ trong khu vực Hà Nội, vận chuyển về phòng thí nghiệm Nguyễn Thị Hiệp và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 123(09): 101 - 106 102 trong vòng 1-2 giờ ở 30-35oC trong dung dịch nước muối sinh lý 0,9%, bổ sung kháng sinh gentamycin 40mg/ml với liều lượng 6ml trên một lít dung dịch nước muối sinh lý. Buồng trứng được thấm máu và rửa lại 3-5 lần trong nước muối 0,9% ở 37oC, thu trứng trong tủ hút vô trùng bằng phương pháp rạch nang từ các nang có kích thước là 2-6 mm. Rửa cụm trứng và tế bào cận noãn trong môi trường TCM199 (TCM -Tissue culture medium) dưới kính hiển vi Nikon ở độ phóng đại 10-20 lần bằng cách dùng kim thủy tinh có kích thước phù hợp. Phân loại chất lượng dựa vào hình thái và số lớp tế bào cận noãn theo phương pháp của Leibfried và First (1979) [8] Chỉ có những trứng loại A, B để nuôi thành thục. Trứng loại A: có trên 3 lớp tế bào cận noãn bao quanh trứng, các lớp tế bào cận noãn này dày, đều đặn, đồng nhất và liên kết chặt chẽ với nhau, nguyên sinh chất của trứng đồng đều, toàn bộ trứng nhìn trong suốt và đầy đặn. Trứng loại B: có từ 2-3 lớp tế bào cận noãn bao quanh trứng, các tế bào này liên kết không chặt chẽ, có nơi bị mất một phần tế bào, nguyên sinh chất đồng đều nhưng hơi tối màu ở vùng ngoại vi trứng, toàn bộ trứng nhìn ít trong và ít đầy đặn hơn. Môi trường nuôi thành thục trứng là môi trường TCM 199 bổ sung 10% FBS (fetal bovine serum - huyết thanh thai bò) với 40-50 trứng /1giếng 500 µl. Trứng lợn sau khi nuôi 44-46 giờ trong môi trường 199 bổ sung 10% FBS có thể đạt đến giai đoạn thành thục (Hình 1-a). Những trứng bông tơi và có tế bào chất đồng nhất được lựa chọn để thụ tinh ống nghiệm. Thụ tinh ống nghiệm (IVF) Môi trường thụ tinh là môi trường Pig-FM cải biên có bổ sung 2 mM caffein và 5 mg/ml huyết thanh thai bò. Kỹ thuật IVF được làm theo phương pháp của Kikuchi và cộng sự (2002) [7]. Kỹ thuật này được mô tả một cách ngắn gọn như sau: Trứng sau khi nuôi trong môi trường TCM 199 bổ sung 10% FBS 44- 46 giờ, tổ hợp trứng-tế bào cận noãn (COCs) được chuyển vào giọt 100 µl môi trường thụ tinh FM được nạp trong đĩa tròn và được phủ dầu paraffin ấm. Mỗi giọt thụ tinh chứa 10-15 trứng được thụ tinh bằng tinh trùng đông lạnh - giải đông của lợn đực giống Landrace. Tinh trùng được ủ trong tủ 37oC phủ dầu ấm 15 phút. Nồng độ tinh cuối cùng trong giọt thụ tinh là là 105 tinh trùng/ml. Trứng được ủ với tinh trùng trong 3 giờ ở 38,5oC, 5% CO2. Ngày thụ tinh được tính là ngày 0. Nuôi phôi in vitro (IVC) Tiến hành tách tế bào tế bào cận noãn và tinh trùng bám quanh trứng khỏi tế bào trứng bằng cách dùng kim thủy tinh có kích thước phù hợp và chuyển trứng vào nuôi trong môi trường IVC: Môi trường IVC gốc là NCSU- 37 cải tiến bằng cách thêm 0,4% huyết thanh thai bò (BSA) (theo thể tích) và 50 µM β- mercaptoethanol. Có hai loại môi trường IVC: IVC-PyrLac (Môi trường IVC cơ bản có bổ sung 0,17 mM natri pyruvat và 2,73 mM natri lactac) và IVC-glu (môi trường cơ bản có bổ sung 5,55 mM glucose). Phôi được nuôi trong tủ nuôi 38,5oC, 5% CO2 trong môi trường IVC PyrLac từ ngày 0 đến ngày 2, sau đó được chuyển sang nuôi trong môi trường có bổ sung glucose cho đến ngày 6. Đánh giá khả năng hình thành tiền nhân, sự phát triển của phôi. Sau thụ tinh từ 8-10 giờ, trứng được cố định trên tiêu bản và đưa vào dung dịch cố định (3 ethanol: 1 acid acetic). Sau 4 ngày, tế bào trứng được nhuộm bằng dung dịch orcein 1% trong 5-7 phút, rửa bằng dung dịch aceto- glycerol (1 acid acetic: 1 glycerol: 3 nước cất). Tiêu bản được để khô và soi dưới kính hiển vi có độ phóng đại 400 lần để đánh sự hình thành tiền nhân đực, tỷ lệ đơn tinh, đa tinh trùng. Sự phát triển của phôi được ghi nhận ở ngày thứ 2 và ngày thứ 6 sau thụ tinh (Ngày thứ 2 ghi nhận tỷ lệ chia của phôi. Ngày thứ 6 đánh giá tỷ lệ hình thành phôi dâu, phôi nang). Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm 1. Ảnh hưởng của các lô tinh tới khả năng thụ tinh bình thường trong thụ tinh Nguyễn Thị Hiệp và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 123(09): 101 - 106 103 ống nghiệm ở lợn: Tế bào trứng lợn nuôi thành thục in vitro được thụ tinh bằng tinh trùng đông lạnh - giải đông của hai lô tinh là TL1, TL2 (TL1, TL2 thu từ mào dịch hoàn của lợn Landrace thu tại lò mổ Thanh Oai, Hà Nội. Mào dịch hoàn được chuyển về phòng thí nghiệm 1-2 giờ sau khi lợn bị giết mổ, đông lạnh theo phương pháp của Kikuchi và cs, 2002. Tinh đông lạnh trong cọng rạ với nồng độ 1 triệu tinh trùng/cọng rạ. Tinh đông lạnh có hoạt lực 30-40%. Các chỉ tiêu theo dõi trong thí nghiệm 1 là : Tỷ lệ thành thục của trứng, tỷ lệ hình thành tiền nhân đực, tỷ lệ đơn tinh trùng, tỷ lệ đa tinh trùng. Tỷ lệ thành thục (%) = Số trứng ở giai đoạn metaphase II + trứng có hình thành tiền nhân/Tổng số trứng thí nghiệm *100 Tỷ lệ hình thành MPN (%) = Số trứng hình thành MPN/Tổng số trứng thí nghiệm *100 Tỷ lệ đơn tinh trùng (%) = Số trứng có 1 MPN/Tổng số trứng thí nghiệm *100 Tỷ lệ đa tinh trùng (%) = Số trứng có trên 2 MPN/Tổng số trứng thí nghiệm *100 Thí nghiệm 2. Ảnh hưởng của các lô tinh tới sự phát triển tiếp theo của phôi lợn thụ tinh ống nghiệm: Tế bào trứng lợn nuôi thành thục in vitro, thụ tinh bằng tinh trùng đông lạnh - giải đông của hai lô tinh TL1, TL2. Kiểm tra tỷ lệ phân chia vào ngày thứ 2, tỷ lệ phôi dâu/phôi nang vào ngày thứ 6 sau thụ tinh. Các chỉ tiêu theo dõi trong thí nghiệm 2 là tỷ lệ phôi chia và tỷ lệ hình thành phôi dâu/phôi nang. Tỷ lệ phôi chia (%) = Số phôi chia/Tổng số trứng thụ tinh *100 Tỷ lệ phôi dâu/phôi nang (%) = Số phôi dâu, phôi nang/Số trứng thụ tinh *100 Xử lý số liệu Số liệu được xử lý bằng phần mềm Excel và Minitab 16. Tỷ lệ hình thành tiền nhân đực, tỷ lệ đơn tinh, tỷ lệ chia, tỷ lệ phôi nang được so sánh bằng phân tích ANOVA One - Way analysis of Variance theo phương pháp Turkey’s test, sự khác biệt P<0,05 là có ý nghĩa. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Ảnh hưởng của các lô tinh đông lạnh tới sự thụ tinh, quá trình hoạt hóa của trứng và tinh trùng Khả năng hình thành tiền nhân đực của tế bào trứng lợn sau thụ tinh chứng tỏ tế bào trứng được thụ tinh và hoạt hóa. Trong thí nghiệm 1 chúng tôi đánh giá ảnh hưởng của các lô tinh đông lạnh tới khả năng hình thành tiền nhân đực, sự thụ tinh bình thường, đa tinh của tế bào trứng lợn. Kết quả ở bảng 1 cho thấy, tỷ lệ hình thành tiền nhân đực (Hình 1-b) của nhóm tế bào trứng thụ tinh bằng tinh đông lạnh TL1, TL2 tương ứng là 75,31% và 57,03%. Lô tinh đông lạnh TL1 cho tỷ lệ hình thành tiền nhân cao hơn lô tinh TL2 (75,31% sv 57,03%) P>0,05. Kết quả hình thành tiền nhân của chúng tôi tương đương với kết quả của tác giả Nguyễn Việt Linh và cs, 2009. [12]. Theo đó, tỷ lệ hình thành tiền nhân đạt từ 50,81% tới 66,03%. Một trong những vấn đề nan giải trong thụ tinh ống nghiệm ở lợn là hiện tượng đa tinh trùng (Hình 1-c), tức là nhiều tinh trùng cùng xâm nhập vào tế bào trứng. Khi tỷ lệ đơn tinh trùng càng cao thì tỷ lệ đa tinh trùng càng giảm. Đây là chỉ tiêu quan trọng cần đánh giá trong thụ tinh ống nghiệm ở lợn. Tỷ lệ đơn tinh trùng của tế bào trứng được thụ tinh bằng lô tinh TL1 cao hơn so với TL2 (40,84% sv 39,61%) P>0,05. Để đánh giá tổng quan chất lượng của các lô tinh đông lạnh sử dụng, chúng tôi tiến hành so sánh các kết quả với các nghiên cứu liên quan của các phòng thí nghiệm khác trên thế giới. Kết quả về tỷ lệ đơn tinh trùng của chúng tôi cũng tương đương với các kết quả của tác giả Nguyễn Việt Linh và cs, 2009 [12]. Theo tác giả, tỷ lệ đơn tinh trùng dao động từ 28,2 ± 6,1% tới 38,3 ± 7,7% tùy vào nồng độ của cystein trong môi trường nuôi thành thục. Nguyễn Thị Hiệp và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 123(09): 101 - 106 104 Bảng 1. Ảnh hưởng của các lô tinh tới khả năng hình thành tiền nhân đưc của trứng thành thục, thụ tinh ống nghiệm Lô tinh Số trứng khảo sát Tỷ lệ hình thành tiền nhân đực – MPN (%) Tỷ lệ đơn tinh trùng (%) Tỷ lệ đa tinh trùng (%) TL1 94 76 (75,31 ± 6,88) 43 (40,84 ± 5,03) 32 (33,52 ± 5,64) TL2 201 122 (57,03 ± 6,83) 78 (39,61 ± 3,7) 44 (17,42 ± 5,71) Bảng 2. Ảnh hưởng của các lô tinh tới sự phát triển tiếp theo của phôi lợn thụ tinh ống nghiệm Lô tinh Số phôi giả định Tỷ lệ phôi chia (%) Tỷ lệ hình thành phôi dâu/phôi nang (%) TL1 179 101 (51,49 ± 5,77) 62 ( 29,96 ± 7,26) TL2 164 84 (52,99 ± 8,13) 31 (16,69 ± 4,31) Tác giả Zăhan và cs, (2006) [13] cũng nghiên cứu về ảnh hưởng của nồng độ tinh tới thụ tinh ống nghiệm ở lợn. So với tác giả Zăhan và cs, (2006) thì kết quả về tỷ lệ thụ tinh bình thường (đơn tinh) của chúng tôi là tương đương. Theo tác giả, nồng độ tinh tối ưu là 7,5 x105 tinh trùng/ml và 10 x105 tinh trùng/ml cho tỷ lệ thụ tinh bình thường là 41,94% và 41,38%, theo thứ tự. Kết quả này xấp xỉ với kết quả về tỷ lệ đơn tinh của chúng tôi (40,84 ± 5,03% và 39,61 ± 3,7%) với lô tinh TL1 và TL2. Nghiên cứu của tác giả Sherrer và cs, (2004) [9]. Tỷ lệ tế bào trứng đơn tinh trùng khi thụ tinh bằng tinh trùng của lợn Boar 18-7 cao hơn so với tinh của lợn Boar 162 tương ứng là (47,0 ± 2,3% vs 33,8 ± 2,3%) với P<0,01. Như vậy, tinh trùng từ lô tinh TL1, TL2 của chúng tôi cho tỷ lệ đơn tinh trùng là (40,84% và 39,61%) thấp hơn so với tinh từ lợn Boar 18-7 (47,0 ± 2,3%) nhưng lại cao hơn so với tinh từ lợn Boar 162 (33,8 ± 2,3%). Cũng theo Sherrer và cs, 2004, hiện tượng đa tinh trùng là 24,8 ± 2,5% đối với tinh của lợn Boar 18-7 và 12.9 ± 2,5% đối với tinh của lợn Boar 162. Trong khi đó kết quả của chúng tôi là 33,52 ± 5,64% đối với TL1 và 17,42 ± 5,71% đối với TL2 cao hơn so với công bố của tác giả Sherrer và cs, (2004). Trong nghiên cứu của tác giả Sherrer và cs, (2004) thì yếu tố cá thể lợn cũng ảnh hưởng tới tỷ lệ đơn tinh, đa tinh. Tuy nhiên trong nghiên cứu của chúng tôi, không có sự khác biệt giữa hai lô tinh TL1, TL2. Nhìn chung, kết quả của chúng tôi về tỷ lệ thụ tinh, tỷ lệ đơn tinh trùng và đa tinh trùng không có sự khác biệt lớn so với kết quả trong công bố của các tác giả Sherrer và cs, 2004 [9]. Tỷ lệ tế bào trứng được thụ tinh bằng tinh trùng lô TL1 cao hơn so với lô TL2 (75,31 ± 6,88% so với 57,03 ± 6,83%), nhưng tỷ lệ đa tinh trùng tương ứng cũng cao hơn (33,52 ± 5,64 so với 17,42 ± 5,71%), P>0,05. Như vậy, xét về phương diện hoạt hóa tế bào trứng ở thời điểm 8 - 10 giờ sau thụ tinh thì cả hai lô tinh TL1 và TL2 đều có thể sử dụng trong thụ tinh ống nghiệm ở lợn. Ảnh hưởng của các lô tinh đông lạnh tới sự phát triển tiếp theo của tế bào trứng lợn sau thụ tinh ống nghiệm Để đánh giá chất lượng của các lô tinh, chúng tôi còn dựa vào tỷ lệ chia của phôi ở ngày thứ hai và tỷ lệ thình thành phôi nang ở ngày thứ 6. Kết quả thể hiện ở bảng 2. Bảng 2 cho thấy, tỷ lệ chia của phôi (Hình 1- d) thu được từ hai lô tinh là TL1, TL2 tương đương (51,49 ± 5,77% so với 52,99 ± 8,13%), P > 0,05. Kết quả của chúng tôi tương đương với kết quả công bố của tác giả Nguyễn Việt Linh và cs, 2009 (51,9 ± 7,7%) [12] ở mức nồng độ cystein là 0,2 mM và Sherrer và cs, 2004 (51,6 ± 3,1%) với tinh từ lợn Boar 162 và thấp hơn so với tinh từ Boar 18-7 (63,0 ± 3,1%). Cũng theo tác giả, nồng độ tối ưu sử dụng là 0,5 x 106 tinh trùng/ml, tỷ lệ chia có thể đạt tới 70,2 ± 6,2%. Nguyễn Thị Hiệp và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 123(09): 101 - 106 105 Hình 1. a-tế bào trứng lợn thành thục (mũi tên chỉ sự xuất hiện thể cực thứ nhất), b-tế bào trứng lợn đơn tinh với tiền nhân đực và tiền nhân cái, c- đa tinh-có trên một tiền nhân đực, d-phôi 2-4 tế bào, e-phôi dâu, f-phôi nang Kết quả về tỷ lệ hình thành phôi dâu (Hình 1- e), phôi nang (Hình 1-f) với lô tinh TL1 cao hơn so với lô tinh TL2 tương ứng là 29,96 ± 7,26 % và 16,69 ± 4,31%, P>0,05. Kết quả này của chúng tôi cao hơn so với công bố của tác giả Sherrer và cs, 2004 [9], với tỷ lệ hình thành phôi nang đạt khoảng 3%, nhưng thấp hơn so với công bố của tác giả Nguyễn Việt Linh và cs, 2009 [12], với tỷ lệ hình thành phôi nang từ 14,8% - 24,3% tùy vào mức nồng độ của cystein trong môi trường nuôi thành thục. Tùy hệ thống nuôi, nồng độ tinh, môi trường nuôi, mà kết quả về tỷ lệ chia, tỷ lệ hình thành phôi nang có sự khác nhau giữa các nghiên cứu trên thế giới. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi về tỷ lệ chia, tỷ lệ hình thành phôi nang sử dụng lô tinh đông lạnh TL1, TL2 ở nồng độ tinh 105 tinh trùng/ml cho tỷ lệ chia khoảng 50% và tỷ lệ phôi dâu/phôi nang từ 16-30% là hoàn toàn chấp nhận được. Từ đó chứng tỏ các lô tinh đông lạnh trên đủ tiêu chuẩn dùng trong thụ tinh ống nghiệm ở lợn. KẾT LUẬN Xét về khả năng hoạt hóa tế bào trứng sau thụ tinh ở thời điểm 8-10 giờ sau thụ tinh. Lô tinh TL1 cho tỷ lệ hình thành tiền nhân cao hơn so với TL2. Tuy nhiên tỷ lệ thụ tinh bình thường (đơn tinh) thì lại ngang nhau (khoảng 40%). Xét về khả năng phát triển của phôi, hai lô tinh TL1, TL2 cho tỷ lệ phân chia khoảng 50%. Tỷ lệ phôi dâu/phôi nang của lô tinh TL1, TL2 từ 16-30%. Qua đó, chúng tôi có thể kết luận rằng cả hai lô tinh TL1,TL2 đều đủ tiêu chuẩn dùng trong thụ tinh ống nghiệm ở lợn. Lời cảm ơn: Công trình này được hoàn thành với sự tài trợ kinh phí của Quĩ phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia cấp cho đề tài mã số 106.12-2012.93 “Nghiên cứu ảnh hưởng của giọt noãn bào chất đơn tinh lên sự hoạt hóa trứng và sự phát triển của phôi”. Các tác giả xin trân trọng cảm ơn đóng góp quý báu của GS. Kazuhiro Kikuchi trong các thí nghiệm và hoàn thành bài báo này. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Nguyễn Thị Ước, Nguyễn Việt Linh, Nguyễn Văn Hạnh, Quản Xuân Hữu, Đặng Nguyễn Quang Thành, Nguyễn Thị Mến, Trần Thị Thơm, Nguyễn Trung Thành, Bùi Linh Chi, Dương Đình Long, Nguyễn Khắc Tích, Phan Ngọc Minh, và Bùi Xuân Nguyên - Sản xuất phôi lơn mini nội địa bằng tổ hợp công nghệ ống nghiệm và nhân bản Nguyễn Thị Hiệp và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 123(09): 101 - 106 106 vô tính. Tạp chí Công nghệ sinh học - số chuyên san 6 (4A) (2008) 625-635. 2. Abeydeera LR. In vitro fertilization and embryo development in pigs. Reproduction Suppl 58 (2001) 159-173. 3. Annadie K., Eric S., Pieter L., Jos V., Ben C., Mart B. The effect of oviductal epithelial cell co-culture during in vitro maturation on sow oocyte morphology, fertilization and embryo development. Theriogenology 59 (2003) 1889-1903. 4. Hunter R. H. F. Fertilization of pig eggs in vivo and in vitro. J Reprod Fertil (Suppl) 40 (1990) 211–226 5. Kashiwazaki N., Kikuchi K., Suzuki K., Noguchi J., Nagai T., Kaneko H., and Shino M. Development In Vivo and In Vitro to Blastocysts of Porcine Oocytes Matured and Fertilized In Vitro. Journal of Reproduction and Development 47 5 (2001) 303-310. 6. Kątska, Książkiewicz L. Pig embryo production by in vitro maturation and fertilization of ovarian oocytes. A review. J Anim Sci 15 (2006) 525-542. 7. Kikuchi K., Onishi A., Kashiwazaki N., Iwamoto M., Noguchi J., Kaneko H., Akita T., Nagai T. Successful piglet production after transfer of blastocysts produced by a modified in vitro syste. Biol Reprod 66 4 (2002) 1033-41. 8. Leibfried L and First N.L. Characterization of bovine follocular oocytes and their ability invitro. Journal of Animal Science 48 (1979) 76-86. 9. Sherrer E. S., Rathbun T. J and. Davis D. L. Fertilization and blastocyst development in oocytes obtained from prepubertal and adult pigs. Journal of Animal Science. 82 (2004) 102-108 10. Sirard M. A., Dubuc A., Bolamba D., Zheng Y., Coenen K. Follicule oocyte-sperm interactions in vivo and in vitro in pigs. J Reprod Fertil (Suppl) 48 (1993) 3-16 11. Suzuki H., Saito Y., Kagawa N., and Yang X. In vitro fertilization and polyspermy in the pig: Factors affecting fertilization rates and cytoskeletal reorganization of the oocyte. Microscopy Research and Technique 61 (2003) 327-334 12. Viet Linh N., Thanh Quang D. N., Nguyen B. X., Manabe N. and Nagai T. Effect of Cystein During In Vitro Maturation of Porcine Oocytes Under Low Oxygen Tension On Their Subsequent In Vitro Fertilization and Development. J.Reprod. Dev. 55 6 (2008) 594-598. 13. Zăhan M., Miclea V., Man C., Miclea I., Roman I. The Influence of Sperm Concentration on Swine In Vitro Fertilization. Buletinul USAMV- CN 62 (2006) 319. SUMMARY THE EFFECT OF FROZEN SPERM FACTOR ON DEVELOPMENTAL COMPETENCE OF PORCINEOOCYTE MATURED, FERTILIZED IN VITRO Nguyen Thi Hiep1, Nguyen Thi Uoc1, Hua Nguyet Mai2, Nguyen Viet Linh1* 1Institute of Biotechnology, Vietnam Academy of Science and Technology. 2College of Science -TNU In vitro fertilization (IVF) is a major technique producing in vitro embryos for biomedical researches and biodiversity conservation in pigs. Main materials in this case are sperm frozen – thawed and oocytes. In this study, we evaluated effect of frozen semen on the ability to form male pronuclei and subsequent development of porcine oocytes matured and fertilized in vitro. Sperm freezing and IVF was carried out according to the method of Kikuchi et al., 2002. The parameters for the evaluationare the incidence of male pronuclei formation, monospermy, cleavage and the morula- blastocyst rates. Frozen sperm from two Landrace porcine TL1 and TL2 stored in nitrogen liquid is used. There was no difference (P>0,05) in male pronuclei formation rate and monospermy rate between TL1 and TL2 groups(85,7 ± 14,3 and 57,03 ± 6,83, respectively), (53,48 ± 5,52 and 39,61 ± 3,7, respectively). The cleavage, morula/blastocyst rates did not differ between TL1 and TL2 (51,49 ± 5,77 and 29,96 ± 7,26, respectively) and (52,99 ± 8,13 và 16,69 ± 4,31, respectively). The results show that the frozen semens are available for using in pig IVF system. Key words: In vitro fertilization, frozen semen, porcine oocyte, male pronuclei, monospermy, morula-blastocyst Ngày nhận bài:30/7/2014; Ngày phản biện:07/8/2014; Ngày duyệt đăng:20/8/2014 Phản biện khoa học: TS. Nguyễn Thị Hải Yến – Trường Đại học Khoa học – ĐH Thái Nguyên * Tel: 0949 492281, Email: nvlinh@ibt.ac.vn