Đánh giá hiệu quả sử dụng enzyme viscozyme l thay thế hóa chất trong sản xuất carrageenan từ rong sụn kappaphycus alvarezii (doty) doty - Bùi Huy Chích

Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2014 10 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG THOÂNG BAÙO KHOA HOÏC ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ SỬ DỤNG ENZYME VISCOZYME L THAY THẾ HÓA CHẤT TRONG SẢN XUẤT CARRAGEENAN TỪ RONG SỤN KAPPAPHYCUS ALVAREZII (DOTY) DOTY EVALUATING THE EFFECT OF USING VISCOZYME L ENZYME REPLACING CHEMICALS IN PRODUCTION OF CARRAGEENAN FROM SEAWEED KAPPAPHYCUS ALVAREZII (DOTY) DOTY Bùi Huy Chích1, Đỗ Văn Ninh2, Vũ Ngọc Bội3 Ngày nhận bài: 16/4/2014; Ngày phản biện thông qua: 16/10/2014; Ngày duyệt đăng: 01/12/2014 TÓM TẮT Phương pháp sử dụng enzyme Viscozyme L xử lý rong trong quá trình sản xuất carrageenan từ rong Kappaphycus alvarrezii (Doty) Doty có nhiều ưu điểm so với phương pháp xử lý rong bằng NaOH. Cụ thể, sử dụng enzyme Viscozyme L xử lý rong cho hiệu suất quy trình và sức đông carrageenan cao hơn, khắc phục những hạn chế của quá trình sản xuất carrageenan theo phương pháp sử dụng NaOH xử lý rong như: carrageenan thu được thường lẫn hóa chất, quá trình tinh chế rất khó khăn, ô nhiễm môi trường, độc hại cho người sản xuất. Từ khóa: Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty, carrageenan, Viscozyme L ABSTRACT Method of using Viscozyme L enzyme for treating seaweed in the production of carrageenan from seaweed Kappaphycus alvarrezii (Doty) Doty has several advantages over the NaOH treatment method. Specifi cally, Viscozyme L enzyme treatment of seaweed gave higher yield and higher carrageenan gelation degree, overcoming the disadvantages of carrageenan production by NaOH treatment where carrageenan obtained was often mixed with chemicals, diffi cult to be refi ned, causing environmental pollution, and harmful to workers. Keywords: Kappaphycus alvarezii (Doty) Doty, carrageenan, Viscozyme L 1 Th.S Bùi Huy Chích: Trường Cao đẳng cộng đồng Bà Rịa Vũng Tàu 2 TS. Đỗ Văn Ninh: Trường Đại học Nha Trang 3 TS. Vũ Ngọc Bội: Khoa Công nghệ thực phẩm - Trường Đại học Nha Trang I. ĐẶT VẤN ĐỀ Rong sụn là nguyên liệu để sản xuất Carrageenan, một loại polysaccharide được biết và sử dụng từ lâu, ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực như chế biến sữa, thịt, mỹ phẩm, thuốc... Tuy nhiên, công nghệ chế biến rong sụn và Carrageenan từ rong sụn ở Việt Nam còn hạn chế nên rong sụn nguyên liệu ít được tiêu thụ trong nước mà chủ yếu chủ yếu xuất khẩu qua thương lái dưới dạng nguyên liệu khô nên rất dễ bị ép giá, bị động trông chờ vào thị trường nước ngoài. Trong khi, hàng năm đất nước ta vẫn phải tốn một lượng ngoại tệ lớn để nhập khẩu các loại Carrageenan làm phụ gia cung cấp cho các ngành công nghiệp trong nước [1]. Hiện tại, các nghiên cứu tập trung vào lĩnh vực nuôi trồng và thu nhận Carrageenan từ rong sụn theo quy trình xử lý rong bằng acid hay kiềm. Phương pháp xử lý này sản xuất Carrageenan còn có một số hạn chế là Carrageenan thu được thường lẫn với hóa chất nên quá trình tinh chế gặp nhiều khó khăn, ô nhiễm môi trường, độc hại với người sản xuất. Do vậy, đòi hỏi bức xúc của thực tiễn đặt ra là cần nghiên cứu phát triển để có được công nghệ sản xuất Carrageenan từ rong sụn hiệu quả, ổn định, hạn chế việc sử dụng hóa chất làm ảnh hưởng đến an toàn thực phẩm và ô nhiễm môi trường cung cấp cho các ngành công nghiệp trong nước và hướng đến xuất khẩu, hạn chế được tình trạng xuất khẩu Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2014 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 11 - Tỷ lệ nước nấu/rong 50/1 - t0C= 950C; - Thời gian nấu 70 phút - Tỷ lệ rong/nước: 20/1 - Nồng độ enzyme: 1% - Nhiệt độ xử lý 450C - pH = 4,6 Rong sụn khô Ngâm (1 - 2h) Xử lý enzyme Rửa Rửa Nấu chiết Lọc nóng Bổ sung KCl Để đông, cắt sợi Cấp đông Rã đông Phơi hoặc sấy Carrageenan KCl 0,3% Bã rong nguyên liệu khô với giá rẻ, nhập khẩu Carrageenan với giá cao như hiện nay. Từ đó, góp phần giải quyết đầu ra cho nghề nuôi trồng rong sụn, nâng cao giá trị thương phẩm. Thúc đẩy nghề trồng rong sụn tại Việt Nam phát triển. Với phương pháp sử dụng enzyme để xử lý rong, phản ứng xảy ra trong điều kiện nhẹ nhàng, hiệu quả cao do tính đặc hiệu của enzyme [6], không độc hại cho người sản xuất và ảnh hưởng đến môi trường, đảm bảo an toàn thực phẩm đang là một hướng nghiên cứu được nhiều nhà khoa học trong và ngoài nước quan tâm.Trong phạm vi bài báo này, chúng tôi không trình bày quá trình nghiên cứu để từ đó đề xuất quy trình sản xuất carrageenan từ rong sụn theo phương pháp xử lý rong bằng enzyme Viscozyme L mà sử dụng luôn quy trình đã nghiên cứu để đánh giá hiệu quả sử dụng enzyme Viscozyme L thay thế hóa chất trong sản xuất carrageenan từ rong sụn. II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Đối tượng nghiên cứu - Nguyên liệu: Rong sụn Kappaphycus alvarrezii (Doty) Doty được nuôi trồng tại đầm Thủy Triều, xã Cam Đức, huyện Cam Lâm, tỉnh Khánh Hòa. Thời gian thu mẫu, ngày 4/4/2013, rong có độ tuổi là 45 ngày. Sau đó, rong được chuyển về phòng thí nghiệm Trường Đại học Nha Trang phơi khô tới độ ẩm ≤ 25%, và được sử dụng để tiến hành tách chiết Carrageenan. - Enzyme Viscozyme L: Của hãng Novozymes do Công ty Nam Giang - 133/7 Hồ Văn Huê, Phường 9, Phú Nhuận, TP. HCM cung cấp, hoạt độ 100 FBG/g, điều kiện thích hợp để chế phẩm hoạt động: pH 3,5 - 5,5 và nhiệt độ 40 - 550C. Bảo quản chế phẩm ở nhiệt độ 1 - 100C. 2. Phương pháp nghiên cứu 2.1. Các phương pháp phân tích - Xác định hàm ẩm: bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi theo tiêu chuẩn TCVN 3700 - 90. - Xác định sức đông theo Craigle (1978) [5]. - Phương pháp nhuộm kép: Dùng để phân biệt một cách rõ ràng các mô của một cơ quan. Những mô có màng tế bào hóa gỗ sẽ bắt màu xanh của phẩm lục iode hoặc xanh methylene. Những mô có màng tế bào cấu tạo bằng cellullose, sẽ bắt màu hồng của phẩm đỏ carmin [4]. - Xác định hiệu suất thu hồi Carrageenan theo công thức [3]: X = A(100-W2) 100%P(100-W1) Trong đó, A: là số gram Carrageenan thu được (g); P: Số gram rong đem nấu chiết (g); W1: Độ ẩm của rong nguyên liệu (g); W2: Độ ẩm của Carrageenan (g). 2.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm Tiến hành thí nghiệm sản xuất carrageenan theo hai quy trình: Xử lý rong bằng enzyme Viscozyme L và sản xuất carrageenan theo phương pháp xử lý rong bằng NaOH trên cùng mẫu rong nghiên cứu. Với mỗi quy trình sản xuất, đánh giá hiệu suất thu hồi sản phẩm, sức đông, pH và màu sắc sản phẩm thu được. Hình 1. Sản xuất carrageenan theo phương pháp xử lý rong bằng enzyme Viscozyme L (Bùi Huy Chích, Đỗ Văn Ninh và cs, 2013) Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2014 12 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Giải thích hình 1: Rong sụn khô được rửa sạch, ngâm trương nở từ 1 - 2 giờ, tiếp đó đem xử lý bằng Viscozyme L với các thông số: Lượng nước gấp 20 lần trọng lượng rong khô; Tỷ lệ enzyme/rong: 1%; Nhiệt độ: 450C; pH môi trường: 4,6; Thời gian: 60 phút. Sau khi xử lý enzyme rong được đem đi rửa nhằm loại bỏ tạp chất tạo ra trong quá trình thủy phân enzyme. Tiếp theo, rong được đem đi nấu chiết ở 950C, tỷ lệ nước/rong khô: 50/1 và thời gian 70 phút. Hỗn hợp được lọc qua một lớp vải, rồi bổ sung 0,3% KCl vào dịch lọc, để đông tự nhiên, cắt miếng, cấp đông, rã đông và làm khô thu sản phẩm carrageenan. - Nhiệt độ 1020C - Thời gian 65 phút - Tỷ lệ nước/rong 52/1 Rong sụn khô Bao gói Phơi/ sấy Làm đông, tan giá Xay nghiền Dịch lọc Lọc Nấu chiết Rửa trung tính Xử lý kiềm Ngâm, rửa KCl 0,06% Bã - Nhiệt độ 300C - Thời gian 40 phút - Nồng độ NaOH 6% Hình 2. Sản xuất carrageenan theo phương pháp xử lý rong bằng NaOH (Đào Trọng Hiếu, 2007) Giải thích hình 2: Rong sụn khô được rửa sạch, ngâm trương nở từ 1 - 2 giờ, tiếp đó đem xử lý với NaOH với các thông số: Lượng nước gấp 20 lần trọng lượng rong khô; Nồng độ NaOH: 6%; Nhiệt độ: 300C; Thời gian: 40 phút. Sau khi xử lý NaOH rong được đem đi rửa trung tính bằng HCl nhằm loại bỏ tạp chất và trung hòa kiềm dư. Tiếp theo, rong được đem đi nấu chiết ở 1020C, tỷ lệ nước/rong khô: 52/1 và thời gian 65 phút. Hỗn hợp được lọc qua một lớp vải, rồi bổ sung 0,06% KCl vào dịch lọc, để đông tự nhiên, cắt miếng, cấp đông, rã đông và làm khô thu sản phẩm carrageenan [2]. Song song, tiến hành chụp hình ảnh và làm tiêu bản đối với rong trước, sau khi xử lý NaOH, enzyme Viscozyme L để quan sát sự thay đổi của thành tế bào rong. Để có được hình ảnh của rong sụn trước và sau khi xử lý với kiềm, enzyme Viscozyme L sử dụng phần mềm máy ảnh của điện thoại iphone 4s. Để quan sát sự thay đổi của thành tế bào rong trước, sau khi xử lý NaOH, Viscozyme L dùng phương pháp nhuộm kép và quan sát dưới kính hiển vi điện tử với độ phóng đại 100X. III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1. Kết quả quan sát hình ảnh thành tế bào rong trước và sau khi xử lý Hình ảnh của rong sụn trước và sau khi xử lý với kiềm, enzyme Viscozyme L thể hiện ở hình 3, hình 4 và hình 5. Vi ảnh thành tế bào rong trước và sau khi xử lý NaOH và Viscozyme L quan sát dưới kính hiển vi bằng phương pháp nhuộm kép được thể hiện ở hình 6, hình 7 và hình 8. Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2014 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 13 1.1. Màu sắc thân rong Màu sắc của thân rong xử lý bằng phương pháp NaOH có màu trắng sáng hơn (hình 3, 4, 5). Do khi dùng kiềm (hình 4) có tác dụng bào mòn thân rong, phá vỡ nhiều lớp tế bào sắc tố, khử sắc tố trong rong nên thân rong thu được có màu trắng sáng. Trong khi đó, dùng enzyme (hình 5) thì khi bào mòn thân rong thì một phần nó đã phá vỡ lớp tế bào sắc tố nhưng vẫn chưa triệt nên sắc tố vẫn còn lưu lại một ít trong thân rong nên màu sắc tối hơn. 1.2. Kích thước thân rong Sau khi xử lý, kích thước thân rong có sự thay đổi rõ rệt, có thể nhận biết bằng mắt thường (hình 3, 4, 5). Cụ thể, kích thước thân rong sau khi xử lý với NaOH 6% giảm nhiều nhất sau đó đến thân rong xử lý bằng enzyme. Do khi xử lý rong bằng NaOH và enzyme có tác dụng bào mòn thân rong. Tuy nhiên, ngoài tác dụng bào mòn thân rong NaOH còn tấn công vào các lớp tế bào bên trong. Đây cũng là cơ sở để giải thích nguyên nhân hiệu suất thu hồi carrageenan của phương pháp xử lý bằng NaOH thấp hơn phương pháp xử lý bằng enzyme. 1.3. Kích thước thành tế bào của rong sụn Thành tế bào của rong sau khi xử lý đều giảm rõ rệt, tùy thuộc vào phương pháp xử lý rong khác nhau mà mức độ giảm khác nhau. Đối với phương pháp xử lý rong bằng NaOH (hình 4, 7) thì thành tế bào mất hẳn và có thể NaOH tấn công cắt Hình 3. Ảnh chụp rong sụn khi chưa xử lý Hình 6. Vi ảnh rong sụn khi chưa xử lý Thành tế bào Hình 4. Ảnh chụp rong sụn sau khi xử lý Hình 7. Vi ảnh rong sụn sau khi xử lý bằng NaOH 6%, T0 thường, τ= 40 phút NaOH 6%, T0 thường, τ= 40 phút Hình 5. Ảnh chụp rong sụn khi xử lý bằng Hình 8. Vi ảnh rong sụn khi xử lý bằng enzyme 1%, T0= 45 0C, pH= 4,6, τ= 60 phút enzyme 1%, T0 = 450C, pH = 4,6, τ = 60 phút Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2014 14 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG mạch Carrageenan. Đối với phương pháp xử lý rong bằng enzyme Viscozyme (hình 5, 8) thành tế bào giảm so với khi chưa xử lý, có thể mất hẳn. 2. Kết quả đánh giá chất lượng Carrageenan theo phương pháp xử lý bằng enzyme với phương pháp xử lý bằng hóa chất Kết quả đánh giá chất lượng Carrageenan theo phương pháp xử lý bằng enzyme với phương pháp xử lý bằng hóa chất được thể hiện ở bảng 1. Kết quả ở bảng 1 cho thấy: Bảng 1. Kết quả đánh giá chất lượng Carrageenan theo phương pháp xử lý bằng enzyme với phương pháp xử lý bằng hóa chất STT Mẫu Hiệu suất (%) Sức đông (g/cm2) pH (Carrageenan 1%) Màu sắc 1 Xử lý bằng NaOH 16,76 580±5 8,6 2 Xử lý bằng enzyme Viscozyme 29,31 617±5 6,2 2.1. Về mặt hiệu suất Sử dụng chế phẩm enzyme Viscozyme L thu được Carrageenan có hiệu suất thu nhận cao hơn khi dùng hóa chất. Do enzyme Viscozyme L có tác dụng bào mòn thành tế bào của thân rong, giúp cho quá trình chiết được triệt để và dễ dàng hơn. Còn khi sử dụng NaOH để xử lý rong, do NaOH là một kiềm mạnh sẽ làm ảnh hưởng đến mạch polysaccharide, cụ thể làm cắt mạch liên kết dẫn đến rong bị gãy vụn, gây thất thoát carrageenan, làm giảm hiệu suất. 2.2. Về sức đông Carrageenan thu được từ phương pháp sử dụng enzyme có sức đông cao hơn hẳn việc sử dụng hóa chất. Do enzyme có tác động nhẹ nhàng vào thành tế bào rong (hình 5, 8) nên ít ảnh hưởng đến cấu trúc của Carrageenan, các liên kết glucoside không bị cắt đứt nên sức đông cao. Tuy nhiên, khi sử dụng kiềm thì ngoài tác động bào mòn thành tế bào rong, nó còn tác động vào chuỗi polysaccharide (hình 4, 7) làm cắt đứt các liên kết glycoside nên sức đông của Carrageenan thấp hơn xử lý bằng enzyme. 2.3. Về pH của dung dịch Carrageenan 1% Carrageenan thu được theo phương pháp xử lý bằng enzyme Viscozyme L có pH nằm trong vùng trung tính (pH 6,2), trong khi Carrageenan thu được theo phương pháp xử lý bằng NaOH có pH nằm trong vùng kiềm tính (pH 8,6). Quá trình ngâm xử lý rong với NaOH 6% trong thời gian 40 phút, NaOH không chỉ phá vỡ thành tế bào bên ngoài của thân rong mà còn có thời gian để thẩm thấu sâu vào các lớp tế bào bên trong thân rong. Do đó, sau khi xử lý xong với kiềm, mặc dù quy trình đã có công đoạn rửa trung tính rong. Tuy nhiên, công đoạn này chỉ loại bỏ được lớp kiềm bám ở bề mặt thân rong và không có tác dụng với các lớp bên trong. Dẫn đến sản phẩm thu được vẫn còn lẫn hóa chất kiềm. Ngoài ra, chính vì công đoạn rửa trung tính không có tác dụng với các lớp bên trong dẫn đến còn tồn dư NaOH trong các lớp tế bào thân rong, nên khi nấu chiết kết hợp với nhiệt độ cao làm cắt mạch Carrageenan dẫn đến sức đông của Carrageenan giảm. Ngoài ra còn gây khó khăn cho công đoạn tinh chế và ứng dụng trong thực phẩm do nhiễm dư lượng NaOH. Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2014 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 15 2.4. Về màu sắc carrageenan Khi xử lý với kiềm ngoài tác dụng bào mòn thân rong còn phá vỡ nhiều lớp tế bào sắc tố, khử sắc tố trong rong và khả năng tẩy trắng nên Carrageenan thu được có màu trắng sáng hơn. Ngoài ra, môi trường kiềm khử được lipid và một số protein hòa tan trong kiềm. Trường hợp xử lý bằng enzyme, trong quá trình bào mòn thân rong thì đã phá vỡ một phần lớn tế bào sắc tố nhưng vẫn chưa triệt để nên sắc tố vẫn còn lưu lại một ít. Do đó, sản phẩm Carrageenan thu được có màu tối hơn so với dùng NaOH trong cùng điều kiện lọc nhưng không chêch lệch đáng kể. IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận Sử dụng enzyme Viscozyme L xử lý rong cho hiệu suất quy trình và sức đông carrageenan cao hơn, khắc phục hạn chế của quá trình sản xuất carrageenan theo phương pháp sử dụng NaOH xử lý rong như: carrageenan thu được lẫn kiềm, ô nhiễm môi trường, độc hại cho người sản xuất. Enzyme Viscozyme L có cơ sở lý thuyết cũng như thực tiễn để thay thế hóa chất xử lý rong sụn Kappaphycus alvarrezii (Doty) Doty trong quá trình sản xuất Carrageenan. 2. Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu thiết kế thiết bị để cơ giới hóa sản xuất, hướng đến việc thương mại hóa sản phẩm; Nghiên cứu thành phần của dung dịch hiện đang bỏ đi sau xử lý enzyme. Từ đó, đề xuất hướng ứng dụng thích hợp, như chế biến phân bón lá trong nông nghiệp; Sau công đoạn lọc, một lượng bã (xác rong) tương đối lớn được loại ra, có thể nghiên cứu chế biến dùng làm thức ăn chăn nuôi hoặc làm phân bón hữu cơ. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Lê Thị Thúy Hằng, 2012. Nghiên cứu sử dụng Enzyme polysaccharase để thu nhận Carrageenan từ rong sụn Kappaphycus alvarzeii (Doty) Doty. Luận văn Thạc sĩ, Trường Đại học Nha Trang. 2. Đào Trọng Hiếu, 2007. Tối ưu hóa quy trình công nghệ tách chiết Carrageenan từ rong sụn Kappaphycus alvarezii. Cục Chế biến, Thương mại Nông Lâm Thủy sản và Nghề muối, Hà Nội. 3. Trần Thị Luyến, 2010. Nghiên cứu xác lập quy trình sản xuất carrageenan bán tinh chế từ rong sụn Kappaphycus alvarezii Cam Ranh - Khánh Hòa. Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản, 1, 3-10. 4. Trần Văn Ơn (Chủ biên), 2012. Thực tập thực vật và nhận biết cây thuốc. Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội. Tiếng Anh 5. Craigie J.C, Leigh C, 1978. Carrageenan and agar. In handbook of phycoligical method, Physiological and Biochemical methods - Cambridge Univ. Press, 9 - 31. 6. Soovendran A/l Varadarajan, Nazaruddin Ramli, Arbakariya Ariff, Mamot Said, Suhaimi Md Yasir, 2009. Development of high yielding carragenan extraction method from Eucheuma Cotonii using cellulase and Aspergillus niger, Prosiding Seminar Kimia Bersama UKM-ITB VIII - 461.