Bài giảng Nuôi cấy tế bào động vật, kĩ thuật và ứng dụng - Bài 4: Kĩ thuật cấy chuyền và tạo dòng

KỸ THUẬT CẤY CHUYỀN VÀ TẠO DÒNG Đại học Quốc gia TP HCM Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên Viện Tế bào gốc CẤY CHUYỀN? Passage / Subculture CẤY CHUYỀN Khi nào thì cần cấy chuyền? When the cell density (cells/cm2 substrate) reaches a level such that all of the available substrate is occupied, or when the cell concentration (cells/mL medium) exceeds the capacity of the medium, growth ceases or is greatly reduced. CẤY CHUYỀN Khi nào thì cần cấy chuyền? Cell Confluency (source: https://www.mirusbio.com/transfectopedia/methods) NUÔI CẤY SƠ CẤP NUÔI CẤY THỨ CẤP Nuôi cấy thứ cấp là nuôi cấy tế bào được tính từ sau lần cấy chuyền đầu tiên SVF (stromal vascular fraction) trước khi được đưa vào nuôi cấy là một phức hợp gồm tế bào máu ngoại vi, MSC, tế bào tiền thân nội mô, tế bào cơ trơn, tế bào quanh mạch (pericyte), nguyên bào sợi, dưỡng bào, tế bào tiền thân tạo mỡ, [38, 115]. Sau vài thế hệ cấy chuyền SVF trong điều kiện tiêu chuẩn, quần thể tế bào trở nên khá tương đồng của tế bào trung mô – ASC [38]. Gentile, P., et al. (2012) Siennicka, K., et al. (2016) CẤY CHUYỀN • HÚT BỎ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY CŨ • RỬA BỀ MẶT GIÁ THỂ NUÔI (CÓ TẾ BÀO BÁM DÍNH) • TÁCH CÁC TẾ BÀO BÁM KHỎI BỀ MẶT DỤNG CỤ NUÔI • PHA LOÃNG CÁC TẾ BÀO BẰNG MÔI TRƯỜNG MỚI Các bước cơ bản của cấy chuyền Subculture of Monolayer. Stages in the subculture and growth cycle of monolayer cells after trypsinization Cấy chuyền tế bào bám dính Loại bỏ môi trường khỏi bình nuôi Rửa bề mặt bình nuôi với PBS- (free Ca2+ Mg2+) Bổ sung dung dịch trypsin/EDTA (0,5- 3ml/bình) Ủ trong tủ ấm 370C Khi tế bào co tròn, nổi lên tiến hành bổ sung một lượng môi trường có chứa huyết thanh Rửa loại bỏ trypsin bằng cách ly tâm 1000- 3000 vòng/phút Tái huyền phù và pha loãng theo tỉ lệ thích hợp 1.Subculture cells once they have reached approximately 80% confluence and are actively proliferating. IMPORTANT: Subculture cells before reaching 100% confluency. 2.Carefully remove the medium from the 10-cm tissue culture plate containing the confluent layer of human mesenchymal stem cells. Apply 3-5 mL of Trypsin-EDTA Solution (SM-2003-C) and incubate in a 37°C incubator for 3-5 minutes. 3.Inspect the plate and ensure the complete detachment of cells by gently tapping the side of the plate with the palm of your hand. 4.Add 5 mL Mesenchymal Stem Cell Expansion Medium (SCM015 or SCM045) to the plate. 5.Gently rotate the plate to mix the cell suspension. Transfer the dissociated cells to a 15 mL conical tube. 6.Centrifuge the tube at 300 x g for 3-5 minutes to pellet the cells. 7.Discard the supernatant 8.Apply 2 mL Mesenchymal Stem Cell Expansion Medium (pre-warmed to 37°C) containing 8 ng/mL FGF-2 to the conical tube and resuspend the cells thoroughly. IMPORTANT: Do not vortex the cells. 9. Count the number of cells using a hemocytometer. 10.Plate the cells at a density of 5,000-6,000 cells per cm2 into the appropriate flasks, plates, or wells in Mesenchymal Stem Cell Expansion Medium containing 8 ng/mL FGF-2. 11.Cells can be frozen in MSC growth media plus 10% DMSO (D2650) at a density of 2X106 cells/vial. Expansion of Mesenchymal Stem Cells CẤY CHUYỀN Các phương pháp tách tế bào lên khỏi bề mặt dụng cụ nuôi 1. Trypsin/EDTA 2. EDTA (EthyleneDiamineTetraAcetic) 3. Scrape 4. CẤY CHUYỀN Vai trò của trypsin/EDTA  aminopolycarboxylic acid, colourless, water-soluble solid  able to "sequester" metal ions such as Ca2+ and Mg2+ CẤY CHUYỀN Vai trò của EDTA C10H16N2O8 CẤY CHUYỀN Scrape Scraper CẤY CHUYỀN Các tiêu chí trong quá trình cấy chuyền 1. Density of Culture CẤY CHUYỀN Các tiêu chí trong quá trình cấy chuyền 2. Exhaustion of Medium CẤY CHUYỀN Các tiêu chí trong quá trình cấy chuyền 3. Time Since Last Subculture Ideally, a cell concentration should be found that allows for the cells to be subcultured after 7 days, with the medium being changed after 3–4 days. (Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications, Sixth Edition) CẤY CHUYỀN Các tiêu chí trong quá trình cấy chuyền 4. Requirements for Other Procedures (1) cells should not be subcultured while still within the lag period (2) cells should always be taken between the middle of the log phase and the time before which they have entered the plateau phase of a previous subculture CẤY CHUYỀN Cell Concentration at Subculture As a general rule, most continuous cell lines subculture satisfactorily at a seeding concentration of between 1 × 10^4 and 5 × 10^4 cells/mL Spinner bioreactor Fig. 13.5. Stirrer Culture. A small stirrer flask, based on the Techne design, with a capacity of 250–1000 mL. The cell suspension is stirred by a pendulum, which rotates in an annular depression in the base of the flask. CẤY CHUYỀN Propagation in Suspension  trypsin treatment is not required so subculture is quicker and less traumatic for the cells  scale-up is easier  replacement of the medium (feeding) is not usually carried out with suspension cultures The passage number is the number of times that the culture has been subcultured, whereas the generation number is the number of doublings that the cell population has undergone, given that the number of doublings in the primary culture is very approximate. passage number / generation number Serial subculture and the relationship between passage number, generation number and split ratio. (Figure modified from Fig. 12.5, Culture of Animal Cells, 4th ed, Freshney (2000) and reproduced by permission of Wiley-Liss, a division of John Wiley & Sons.) TẠO DÒNG? Cloning Once a primary culture is subcultured (or passaged), it becomes known as a cell line. This term implies the presence of several cell lineages of either similar or distinct phenotypes. If one cell lineage is selected, by cloning (see Protocol 14.1), by physical cell separation (see Chapter 15), or by any other selection technique, to have certain specific properties that have been identified in the bulk of the cells in the culture, this cell line becomes known as a cell strain. Cell line / Cell Clone / Cell lineage / Cell Strain Cell lineage denotes the developmental history of a tissue or organ from the fertilized embryo. Cell lineage can be studied by marking a cell (with fluorescent molecules or other traceable markers) and following its progeny after cell division. Cloning is to isolate pure cell strains or cloning may help to reduce the heterogeneity of a culture TẠO DÒNG? Cloning If a cell line transforms in vitro, it gives rise to a continuous cell line, and if selected or cloned and characterized, it is known as a continuous cell strain. continuous cell line / continuous cell strain Dilution Cloning Cloning in Microtitration Plates Cloning in Suspension Some cells, particularly hematopoietic stem cells and virally transformed fibroblasts, clone readily in suspension. To hold the colony together and prevent mixing, the cells are suspended in agar or Methocel and plated on an agar underlay or into dishes that need not be treated for tissue culture. Feeder Layers. Cells are irradiated and trypsinized (or may be trypsinized first and then irradiated in suspension, or treated with mitomycin C) and seeded at a low density to enhanc e cloning efficiency. (Photo courtesy of M. G. Freshney.) TẠO DÒNG Thu nhận dòng Isolation of Monolayer Clones TẠO DÒNG Thu nhận dòng Isolation of Suspension Clones KHÓ KHĂN VÀ GIẢI PHÁP TRONG CHỌN DÒNG TẾ BÀO  Dòng tế bào có thời gian phân chia giới hạn, sau vài lần cấy chuyền sẽ lão suy, thoái hóa: Clone không phát triển mãi, có thể biến đổi, đặc điểm mong muốn thay đổi  1 tế bào khó sống cần có môi trường đặc biệt, bổ sung GF, đồng nuôi cấy với feeder  Đại thực bào và tế bào thần kinh không phân chia in vitro --> có thể dùng như nuôi sơ cấp ỨNG DỤNG CỦA TẠO DÒNG TẾ BÀO Sản xuất kháng thể đơn dòng ỨNG DỤNG CỦA TẠO DÒNG TẾ BÀO Liệu pháp gene ỨNG DỤNG CỦA TẠO DÒNG TẾ BÀO Các ứng dụng khác trong mô hình thử nghiệm in vitro  Nghiên cứu sinh học tế bào: chu trình tế bào  Cải tiến di truyền: tăng năng suất tạo sản phẩm sinh học  Dòng tế bào ung thư: thử nghiệm chất kháng phân bào  Dòng fibroblast: thử nghiệm tính gây kích thích của mỹ phẩm 