Phân lập và nuôi cấy tế bào gốc tủy răng chuột

TCNCYH 82 (2) - 2013 13 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Summary PURIFICATION OF RECOMBINANT CELL PERMEABLE PROTEINS AND THE POSSIBILITY FOR PROTEIN THERAPY Inactivated proteins caused many human diseases. Protein therapy is one of the therapies for many diseases related to a defected protein or inhibitor of a biological process to stop the growth of the tumor. Here, we present the results of improved recombinant cell-penetrating peptides (rCPPs). These rCPPs can serve as new tools for delivering protein in biology and medicine ap- plications. We cloned the CPP in-frame with green fluorescent protein (rCPP - GFP). We were able to express and purify full-length rCPP - GFP fusion proteins. The results showed that, each purified r.protein was tested in Hela and Jurkat cell lines for their transduction efficiency and trans- location. The purified rCPPs - GFP fusion proteins have biological activity as good as HIV virus derived TAT - EGFP peptides. The expressed rCPPs-EGFPs were able to translocate across both the cytoplasm and nucleus, thus, these intracellular regulatory proteins can be used as protein transporters for therapeutic purposes. Key words: CPP, protein recombination, TAT, therapeutic protein PHÂN LẬP VÀ NUÔI CẤY TẾ BÀO GỐC TỦY RĂNG CHUỘT Hoàng Đạo Bảo Trâm1, Tô Minh Quân2, Đoàn Nguyên Vũ2, Nguyễn Thị Ngọc Mỹ2, Lê Thị Ngọc Hương2, Lưu Phương Nam3, Phan Kim Ngọc2 1Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh 2Trường đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh 3Trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh Thử nghiệm phân lập và nuôi cấy tế bào gốc tủy răng chuột được tiến hành trên 15 mẫu tủy răng chuột nhắt trắng Mus musculus var. albino 2 - 3 tuần tuổi. Răng cửa hàm dưới chuột được xử lý bằng dung dịch Peniciline 400UI/ml, Streptomycine 400µg/ml trong 20 phút. Mảnh mô tủy răng được nuôi cấy sơ cấp trên đĩa 35mm trong môi trường DMEM/F12, bổ sung FBS 10%, Peniciline 100UI/ml, Streptomycine 100µg/ml, ở điều kiện 37oC, CO2 5%. Sau 3 tuần, các tế bào hợp dòng, cấy chuyền sang Flask 25cm2 và tiếp tục quá trình nuôi cấy thứ cấp cho tới thế hệ thứ tư (P4). Sự biểu hiện các marker bề mặt của tế bào được đánh giá bằng phương pháp Flow Cytometry. Kết quả cho thấy tế bào tủy răng chuột P4 có biểu hiện các marker của tế bào gốc trung mô CD73, CD90, CD105 và không biểu hiện các marker của tế bào máu CD19, CD34, CD45. Các tế bào có thời gian nhân đôi là 45 giờ và đỉnh đường cong tăng trưởng đạt vào ngày thứ 7. Tế bào gốc tủy răng chuột đã được nuôi cấy thành công bằng phương pháp nuôi cấy mảnh mô tủy răng chuột. Từ khóa: tế bào gốc tủy răng, phân lập tế bào, nuôi cấy tế bào I. ĐẶT VẤN ĐỀ Tủy răng là mô liên kết chứa các tế bào, mạch máu và thần kinh, có chức năng duy trì sự sống của răng. Tương tự như tủy xương, tủy răng chứa các tế bào gốc trung mô. Ngoài ra, tủy răng còn chứa tiền nguyên bào ngà và 14 TCNCYH 82 (2) - 2013 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Địa chỉ liên hệ: Hoàng Đạo Bảo Trâm, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh - 217 Hồng Bàng, Quận 5, Thành phố Hồ Chí Minh. Email: hoangdaobaotram@gmail.com Ngày nhận: 14/3/2013 Ngày được chấp thuận: 26/4/2013 tế bào tạo máu. Có thể nói tế bào tủy răng là nguồn nguyên liệu quý đối với các nghiên cứu trong lĩnh vực tái tạo mô răng và nha chu [1]. Các mô hình nghiên cứu in vitro và mô hình nghiên cứu trên động vật là những giai đoạn thử nghiệm quan trọng để chuẩn bị cho các nghiên cứu ứng dụng tiếp theo trên người. Nhiều tác giả trên thế giới đã sử dụng chuột trong các thử nghiệm về tế bào gốc của răng và tiềm năng biệt hóa và tạo mô của các tế bào này. Các dòng tế bào tủy răng chuột biểu hiện các phân tử bề mặt tế bào tương tự như tế bào gốc tủy răng người, đây là những phương tiện quý báu để xác định kiểu hình của các dạng tế bào tiền thân khác nhau, dựa trên các mức độ biểu hiện dưới quần thể khác nhau của các phân tử bề mặt tế bào, từ đó có thể đánh giá tiềm năng sửa chữa ở tủy răng cũng như đối với các tổn thương mô vùng sọ - mặt [2]. Nghiên cứu của Balic và cộng sự thực hiện năm 2010, đánh giá trong điều kiện in vitro các đặc tính của tế bào tiền thân của tủy răng cửa của chuột. Kết quả nghiên cứu cho thấy tủy răng cửa hàm dưới chưa mọc và đã mọc chuột chứa một quần thể giàu tế bào tiền thân và rất ít tế bào gốc, tương tự như các răng cối chưa mọc của chuột; và quá trình liên tục tạo nguyên bào ngà và ngà răng ở mặt ngoài và mặt trong của các răng cửa được thực hiện bởi quần thể tế bào tiền thân chứ không phải từ các tế bào gốc trung mô đa năng có trong tủy răng [3, 4]. Trong khi đó, quần thể tế bào tủy răng cối đã mọc của chuột chỉ chứa một số lượng nhỏ tế bào đa năng [4]. Trong một thử nghiệm in vitro khác, Shahrul và cộng sự tiến hành phân lập tế bào gốc tủy răng chuột. Các tế bào này có tốc độ tăng sinh cao và có khả năng biệt hóa thành các tế bào tạo sụn [5]. Nằm trong một chuỗi nghiên cứu thử nghiệm in vitro về tế bào gốc tủy răng được phối hợp thực hiện giữa Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh và Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh. Nghiên cứu này được tiến hành nhằm mục tiêu: phân lập và nuôi cấy tế bào gốc của tủy răng chuột. II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 1. Phân lập và nuôi cấy tế bào tủy răng chuột Tủy răng được thu nhận từ răng hàm dưới chuột nhắt trắng Mus musculus var. albino, 2 - 3 tuần tuổi, cân nặng 20 - 25g. Răng hàm dưới chuột được xử lý bề mặt bằng dung dịch Peniciline 400UI/ml và Streptomycine 400µg/ ml trong 20 phút. Mảnh mô tủy được thu nhận và nuôi cấy sơ cấp trong môi trường DMEM/F12 (Sigma) bổ sung huyết thanh bào thai bò (FBS) 10% (Sigma), Peniciline 100UI/ml (Sigma), Strepto- mycine 100µg/ml (Sigma) ở điều kiện 37oC, 5% CO2. Ở thời điểm hợp dòng, các tế bào được cấy chuyền sang chai nuôi cấy Flask 25cm2 bằng dung dịch Trypsin/EDTA 0,25%: 0,02% (Sigma). Quá trình nuôi cấy thứ cấp được tiếp tục thực hiện trong môi trường DMEM/F12 bổ sung FBS 10%, Peniciline 100UI/ml, Streptomycine 100µg/ml ở điều kiện 37oC, CO2 5%. 2. Xác định tính gốc của tế bào tủy răng chuột Tế bào tủy răng chuột được kiểm tra sự biểu hiện các marker bề mặt CD73, CD90, TCNCYH 82 (2) - 2013 15 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC CD105 và CD19, CD34, CD45 bằng phương pháp Flow Cytometry. Phương pháp này sử dụng các loại kháng thể được gắn các hạt phát huỳnh quang và có khả năng nhận diện đặc hiệu một số marker bề mặt tế bào. Nếu tế bào biểu hiện marker cần quan tâm, tế bào và kháng thể đặc hiệu sẽ liên kết với nhau tại marker tạo thành phức hợp tế bào - kháng thể. Phức hợp này được nhận diện bởi máy FACS thông qua hạt phát huỳnh quang trên kháng thể. Nếu không biểu hiện, phức hợp tế bào - kháng thể không được hình thành, không thể được nhận diện bởi máy FACS. 3. Xây dựng đường cong tăng trưởng tế bào Đường cong tăng trưởng tế bào được xây dựng bằng cách xác định số lượng tế bào sống phát triển từ quần thể tế bào ban đầu qua các mốc thời gian. Tế bào được nuôi cấy vào 33 giếng của đĩa 96 giếng với mật độ 103 tế bào/giếng. Mỗi ngày thực hiện đếm số lượng tế bào sống trong 3 giếng bằng phương pháp nhuộm Trypan Blue, thí nghiệm được tiến hành liên tục trong 11 ngày. III. KẾT QUẢ 1. Kết quả phân lập và nuôi cấy tế bào tủy răng chuột Quá trình nuôi cấy tế bào được quan sát hàng ngày qua kính hiển vi quang học đảo ngược. Sau 7 ngày, có thể quan sát được hiện tượng tế bào bám trải xung quanh mảnh mô. Lúc này, các tế bào có rất nhiều hình dạng khác nhau như dạng hình thoi, dạng kéo dài, dạng hình sao, dạng giống tế bào nội mô. Ngoài ra, các tế bào hồng cầu từ các mạch máu của tủy răng xuất hiện xung quanh mảnh mô. Tuy nhiên, hồng cầu không có khả năng bám vào bề mặt đĩa nuôi cấy và bị loại dần sau một số lần thay môi trường. Hình 1. Hình ảnh qua hiển vi quang học đảo ngược, tế bào tủy răng chuột nuôi cấy sơ cấp a: Ngày 1: Mảnh mô tủy răng; b: Ngày 7: Tế bào bám trải từ rìa mảnh mô; c: Ngày 14: Tế bào bao quanh hoàn toàn mảnh mô; d: Ngày 21: Tế bào hợp dòng. d c b a 16 TCNCYH 82 (2) - 2013 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Trong những ngày nuôi cấy tiếp theo, các tế bào dần dần biểu hiện hình thái đặc trưng của tế bào trung mô: tế bào trải dài, nhân lớn hình oval trở nên chiếm ưu thế. Đến ngày thứ 14, hầu hết các tế bào có hình thái khá đồng nhất, rải rác một vài tế bào có dạng hình sao và dạng kéo dài. Các tế bào bắt đầu hợp dòng vào khoảng ngày thứ 19 - 20, mật độ tế bào chiếm 80 - 90% diện tích bề mặt nuôi cấy. Sau 3 tuần, các tế bào đã hợp dòng, trải thành một lớp đơn phủ kín bề mặt đĩa nuôi (hình 1). Quá trình nuôi cấy sơ cấp kết thúc vào thời điểm 3 tuần, các tế bào tủy răng được cấy sang chai nuôi cấy mới nhằm tăng diện tích cho tế bào bám dính và tăng sinh. Trong giai đoạn nuôi cấy sơ cấp, các tế bào trải qua các giai đoạn có hình thái và kích thước khá đa dạng. Ở các thế hệ tế bào tiếp theo, tế bào có hình dạng khá đồng nhất, các tế bào dạng hình thoi chiếm ưu thế, đây là hình dạng đặc trưng của tế bào trung mô (hình 2). Đối với các tế bào nuôi cấy thứ cấp, như P1, P2, P3, P4, thời gian hợp dòng của tế bào vào khoảng 7 - 8 ngày. Như vậy, tốc độ tăng sinh của tế bào nuôi cấy thứ cấp cao hơn so với tế bào nuôi cấy sơ cấp. Hình 2. Hình ảnh qua hiển vi quang học đảo ngược tế bào tủy răng chuột P4 hợp dòng (a: x 40); b: x 100). a b 2. Kết quả xác định tính gốc của tế bào tủy răng chuột Tế bào tủy răng chuột thế hệ thứ tư (P4) được xác định tính gốc bằng phương pháp Flow Cytometry. Kết quả cho thấy tỷ lệ tế bào tủy răng chuột P4 dương tính với các marker CD73 (99,75%), CD90 (91,92%,), CD105 (99,4%) và âm tính với các marker CD19 (1,53%), CD34 (0,86%), CD45 (0,47%) (hình 3). 3. Kết quả xây dựng đường cong tăng trưởng tế bào Sự tăng sinh tế bào được đánh giá bằng phương pháp nhuộm Trypan Blue. Biểu đồ 1 mô tả số lượng tế bào sống được đánh giá mỗi ngày trong quá trình nuôi cấy. Sau ngày thứ nhất, tế bào có biểu hiện giảm số lượng. Các tế bào tăng sinh mạnh từ ngày 1 đến ngày 6 và có xu hướng ngừng hoạt động tăng sinh. Từ ngày thứ 7, số lượng tế bào giảm dần. Thời gian nhân đôi của tế bào là 45 giờ. Kết quả các thí nghiệm trên cho thấy tế bào được thu nhận và nuôi cấy có dạng hình thoi, dài 80 - 100 µm, rộng 15 - 20 µm. Tế bào có biểu hiện những marker dương tính của tế bào trung mô như CD73, CD90, CD105 và không biểu hiện những marker âm tính với tế bào trung mô như CD19, CD34, CD45. Dựa trên các tiêu chuẩn của Hiệp hội quốc tế về tế bào gốc [6], các tế bào phân lập và nuôi cấy từ mảnh mô tủy răng chuột trong thử nghiệm này được xác định là tế bào gốc trung mô. TCNCYH 82 (2) - 2013 17 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Hình 3. Kết quả đánh giá marker bề mặt tế bào tủy răng chuột Biểu đồ 1. Đường cong tăng trưởng của tế bào tủy răng chuột thế hệ thứ tư IV. BÀN LUẬN Tế bào gốc trung mô (Mesenchymal Stem Cells - MSC) là những tế bào có khả năng tự phân chia và biệt hóa thành nhiều dòng tế bào có nguồn gốc trung mô như tế bào tạo sụn, xương, mỡ, cơ và mô liên kết đệm. Do đó, MSC được xem là nguồn tế bào gốc nhiều triển vọng cho các phương pháp điều trị bằng liệu pháp tế bào. MSC được đặc trưng bởi các marker in vitro như STRO-1, CD146, CD73, CD90, CD105 hoặc CD44, 14. STRO-1 là một protein màng dùng để xác định các tế bào gốc trung mô ở tủy xương. MSC được thu từ nhiều nguồn như tủy xương, máu cuống rốn, mô mỡ, răng... MSC từ răng là nguồn tế bào tự thân được thu nhận dễ dàng, ít gây xâm lấn và có tiềm năng biệt hóa thành các loại tế bào răng. Đường cong tăng trưởng 18 TCNCYH 82 (2) - 2013 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Kết quả thu nhận được từ các thí nghiệm trên cho thấy tế bào nuôi cấy từ mảnh mô tủy răng của chuột có hình dạng và kích thước tương tự tế bào gốc trung mô khác như trung mô tủy xương chuột, trung mô tủy răng người. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu của Tadashige Nozaki và cộng sự [7], Shiro Fuji- wara và cộng sự [8], Balic và cộng sự [3, 4]. Hiện nay, các phương pháp nhằm phục hồi tủy răng như là tái tạo mạch máu bằng khối máu đông, sử dụng tế bào gốc, ghép tủy, ghép khung nâng đỡ, phân phối tế bào, liệu pháp gen là những lĩnh vực đang được quan tâm nghiên cứu. Một số công trình trên thế giới và tại Việt Nam đã tiến hành nghiên cứu phân lập và nuôi tế bào gốc tủy răng cũng như tạo khung nâng đỡ trong công nghệ tạo mô răng, hướng đến các ứng dụng sinh học và lâm sàng [9, 10, 11, 12]. Đề tài là một đóng góp trong lĩnh vực nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc tủy răng. Kết quả nghiên cứu cho thấy khả năng phân lập và nuôi cấy thành công tế bào từ mô tủy răng của chuột. Các tế bào biểu hiện và duy trì được đặc tính gốc trong quá trình nuôi cấy in vitro. Những kết quả ban đầu này là tiền đề cho hướng nghiên cứu về ứng dụng tế bào gốc trong chuyên ngành Răng Hàm Mặt ở Việt Nam. V. KẾT LUẬN Thử nghiệm phân lập và nuôi cấy tế bào gốc tủy răng chuột được tiến hành trên 15 mẫu tủy răng chuột nhắt trắng Mus musculus var. albino 2-3 tuần tuổi. Tế bào gốc tủy răng chuột đã được phân lập và nuôi cấy thành công bằng phương pháp nuôi cấy mảnh mô trong môi trường DMEM/F12, bổ sung FBS 10%, Peniciline 100UI/ml, Streptomycine 100µg/ml, ở điều kiện 37oC, CO2 5%. Lời cảm ơn Đề tài được thực hiện bằng nguồn kinh phí của Chương trình Khoa học và Công nghệ trọng điểm cấp nhà nước “Nghiên cứu ứng dụng và phát triển công nghệ tiên tiến phục vụ bảo vệ và chăm sóc sức khỏe cộng đồng”, Mã số KC.10/11-15, Bộ Khoa học và Công nghệ. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Hoàng Đạo Bảo Trâm, Tạ Thành Văn (2012). Tế bào gốc trung mô của răng và tiềm năng tái tạo mô. Tạp chí nghiên cứu Y học 1, 153 - 4. 2. Lacerda-Pinheiro S, Dimitrova-Nakov S., Harichane Y et al (2012). Concomitant multipotent and unipotent dental pulp progenitors and their respective contribution to mineralized tissue formation. European Cells Materials 23, 371 - 386. 3. Balic A., Mina M et al (2010). Charac- terization of progenitor cells in pulp of murine incisors. J Dent Res 89(11), 1287 - 1292. 4. Balic A. Aguila H.L., Caimano M.J et al (2010). Characterization of stem and progenitor cells in the dental pulp of erupted and unerupted murine molars. University of Connecticut Health Center Research. Bone 46 (6), 1639 - 1651. 5. Zainal Ariffin S.H., Kermani S., Megat Abdul Wahab R et al (2012). In Vitro Chondrogenesis Transformation Study of Mouse Dental Pulp Stem Cells. The Scientific World Journal 2012, 1 - 7. 6. Domicini M., Le Blanc K., Mueller I et al (2006). Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy 8(4), 315 - 317. TCNCYH 82 (2) - 2013 19 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC 7. Tadashige Nozaki., Takeyasu M., Hirao A et al. (2005). Differentiation of Rat Dental Pulp-derived Cells into an Osteoblastic Lineage. Oral Science International 2(2), 118 - 125. 8. Fujiwara S., Kumabe S., Iwai Y. et al (2006). Isolated Rat Dental Pulp Cell Culture and Transplantation with an Alginate Scaffold. Okajimas Folia Anat Jpn 83(1), 15 - 24. 9. Đoàn Nguyên Vũ, Phạm Trần Hương Trinh, Nguyễn Thị Nhật Uyên et al (2011). Nuôi cấy tế bào gốc từ tủy răng người. Tạp chí công nghệ sinh học 9(3), 297 - 301. 10. Gronthos S., Mankani M., Brahim J et al (2000). Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci USA 97(25), 13625 - 30. 11. Huang GT., ., Sonoyama W., Chen J et al. (2006). In vitro characterization of human dental pulp cells: various isolation methods ang culturing enviroment, Cell and Tissue Research 324(2), 225 - 236. 12. Trần Lê Bảo Hà, Đoàn Nguyên Vũ, Tô Minh Quân et al (2011). Study on culture of human dental pulp stem cells to apply in tissue engineering Journal of Biomimetics. Biomaterials & Tissue Engineering 11, 13 - 20. Summary ISOLATION AND CULTURE DENTAL PULP STEM CELLS OF MICE INCISORS The goal of this study is to isolate and culture dental pulp stem cells (DPSCs) from mouse mandibular incisors. Mandibular incisors from 2 - 3 weeks old mice were collected and sterilized in a solution of 400 IU/ml Penicilline and 400 IU Streptomycin for 20 minutes. Dental pulp fragments were isolated and incubated in 35mm-dish containing DMEM/F12, supplemented with 10% FBS, 100UI/ml Peniciline, 100µg/ml Streptomycine, at 37oC and 5% CO2. After 3 weeks, confluent cells were stripped and transferred to 25 cm2 tissue culture flask and maintained up to passage 4 (P4). At P4, DPSCs were identified using immunofluorescent flow cytometry method. Dental pulp culture cells at passage 4 expressed high levels of mesenchymal stem cell markers such as CD73, CD90, CD105, and a low level of endothelial hematopoietic cells such as CD19, CD34, and CD45. We also found that DPSCs reach a maximal proliferation levels at day 7, and have a cell population doubling time of 45 hours. Conclusion: We have successfully isolated, cultured and characterized dental pulp stem cells in mice using a simple tissue cell culture method.. Key words: dental pulp stem cells (DPSCs), cell isolation, cell culture