Định lượng acid homovanillic (HVA) và acid vanillylmandelic (VMA) trong nước tiểu bằng sắc ký khí khối phổ

TCNCYH 82 (2) - 2013 1 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC ĐỊNH LƯỢNG ACID HOMOVANILLIC (HVA) VÀ ACID VANILLYLMANDELIC (VMA) TRONG NƯỚC TIỂU BẰNG SẮC KÝ KHÍ KHỐI PHỔ Trần Thị Chi Mai1, Trần Thị Thu Trang2, Hoàng Trung Kiên2 1Trường Đại học Y Hà Nội, 2Bệnh viện Nhi Trung ương Nghiên cứu này nhằm xây dựng và hiệu chuẩn quy trình kỹ thuật định lượng đồng thời acid homovanillic (HVA) và acid vanillylmandelic (VMA) niệu bằng sắc ký khí khối phổ. Phương pháp định lượng đồng thời HVA và VMA niệu bằng sắc ký khí khối phổ (GCMS) được xây dựng dựa trên phương pháp phân tích acid hữu cơ: tách chiết HVA và VMA trong nước tiểu, tạo dẫn xuất di - và tri (trimethylsilyl), phân tách và định lượng bằng phương pháp SIM trên GCMS. Giới hạn phát hiện của phương pháp là 0,9 µmol/L cho HVA và VMA. Khoảng tuyến tính của HVA là 5,68 đến 192,9 µmol/L, của VMA là 3,2 đến 221 µmol/L. Sai số toàn bộ tính toán của phương pháp nhỏ hơn sai số cho phép. Qui trình kỹ thuật định lượng đồng thời VMA và HVA niệu bằng phương pháp GCMS xây dựng được là chính xác và xác thực, có thể sử dụng để phục vụ chẩn đoán và theo dõi điều trị u nguyên bào thần kinh. Từ khoá: acid homovanillic, acid vanillylmandelic, sắc ký khí khối phổ, u nguyên bào thần kinh I. ĐẶT VẤN ĐỀ Các khối u có nguồn gốc từ mào thần kinh như u nguyên bào thần kinh (UNBTK- Neuroblastoma) hay u tuỷ thượng thận (Pheochrocytomas) có đặc điểm là tăng bài tiết catecholamin. Do vậy, việc định lượng catecholamin (noradrenalin, adrenalin) và các sản phẩm chuyển hoá của chúng như acid homovanillic (HVA) và acid vanillylmandelic (VMA) đóng vai trò quan trọng trong chẩn đoán và theo dõi điều trị các bệnh nhân u nguyên bào thần kinh, u tuỷ thượng thận [1; 2]. Trên thế giới, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance liquid choro- matography- HPLC) thường được sử dụng định lượng HVA và VMA trong nước tiểu.Tại Việt Nam, có rất ít phòng xét nghiệm định lượng VMA niệu và phương pháp sử dụng là đo quang sau khi đã tiến hành tinh sạch một phần VMA bằng sắc ký trao đổi ion. Phương pháp này rẻ tiền, đơn giản nhưng độ chính xác không cao vì nhiều yếu tố nhiễu. Trước khi định lượng VMA niệu bệnh nhân không được ăn một số thực phẩm như chuối, sô cô la. Hiện tại chưa có phòng xét nghiệm nào ở Việt Nam triển khai kỹ thuật định lượng HVA niệu. Việc định lượng đồng thời HVA và VMA niệu bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ là một phương pháp nhạy và đặc hiệu, được nhiều tác giả trên thế giới phát triển và sử dụng trong sàng lọc và chẩn đoán u nguyên bào thần kinh [1; 2]. Việc chuẩn hóa kỹ thuật này và đưa vào ứng dụng trong điều kiện phòng xét nghiệm của nước ta nhằm cải thiện việc chẩn đoán và theo dõi u nguyên bào thần kinh là cần thiết. Vì vậy đề tài này được tiến hành với mục tiêu: xây dựng và hiệu chuẩn qui trình kỹ thuật định lượng đồng thời VMA và HVA niệu bằng phương pháp sắc ký khối phổ. II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 1. Chất liệu nghiên cứu Thiết bị: GCMS (GC 7890A - MS 5975) của Agilent. Cột sắc ký HP- 5MS 30m x 0,25 Địa chỉ liên hệ: Trần Thị Chi Mai, Khoa Kỹ thuật Y học, Trường Đại học Y Hà Nội Email: mai.duong2@yahoo.com Ngày nhận: 08/01/2013 Ngày được chấp thuận: 26/4/2013 2 TCNCYH 82 (2) - 2013 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC mm internal diameter x 0,25 um film thickness (Agilent).Hệ thống làm bay hơi dung môi bằng khí nitơ. Hóa chất: Acid 3-phenylbutyric của hãng Sigma- Aldrich, BSTFA (N,O-bis(trimethylsilyl) trifluoroacetamide) của hãng Supelco, Ethyl acetate của Fluka. Lyphocheck Quantitative Urine Control level 1 và level 2 của hãng Bio-Rad. Chuẩn HVA/VMA (Calibrator for HVA/VMA urine) của hãng Recipe. Các dung môi và hoá chất khác của hãng Merck đều có độ tinh khiết ở mức phân tích. Bệnh phẩm: Mẫu nước tiểu ngẫu nhiên của trẻ khoẻ mạnh và trẻ bị u nguyên bào thần kinh, được acid hoá bằng HCl 6M ngay sau khi thu thập và được bảo quản ở -20oC cho đến khi phân tích. 2. Phương pháp 2.1. Xây dựng quy trình kỹ thuật định lượng đồng thời HVA và VMA niệu Chuẩn bị mẫu: cho 50 µl nội chuẩn acid 3- phenyl butyric vào 1 ml nước tiểu, hỗn hợp trên được bão hòa bằng NaCl và được chiết tách bằng ethyl acetate trong môi trường acid (pH < 1). Làm khô mẫu được tách chiết bằng khí nitơ. Ủ mẫu với BSTFA trong 75 phút ở 80°C để gắn các nhóm trimethylsilyl (trong BSTFA) với 2 nhóm -OH của phân tử HVA, với 3 nhóm -OH của VMA. Phân tích GCMS được tiến hành trên cột sắc ký HP - 5MS 30m x 0,25 mm internal diameter x 0,25 um film thickness (Agilent). Mẫu được bơm bằng bộ bơm mẫu tự động Agilent 7693. Chương trình nhiệt độ lò từ 160oC đến 280oC trong vòng 15,8 phút. Tốc độ khí He qua cột là 1 ml/ phút. HVA và VMA được phát hiện bằng phổ khối theo phương pháp SIM (selected ion monitoring). Các ion đặc hiệu cho mỗi chất được lựa chọn. Đường chuẩn được xây dựng bằng chạy các hỗn hợp chuẩn chứa một lượng HVA và VMA chuẩn đã biết và chuẩn nội. Ba mức chuẩn được phân tích trên sắc ký khối phổ mỗi khi chạy mẫu thử, các đỉnh tạo ra được đo bằng phương pháp SIM và đường chuẩn ba điểm được thiết lập cho mỗi chất phân tích. Sau khi thiết lập đường chuẩn ba điểm cho HVA và VMA, định lượng HVA và VMA trong mẫu thử bằng phần mềm Chemstation. Sử dụng chuẩn nội để hiệu chỉnh sự mất mát trong quá trình chuẩn bị mẫu. Hai mức vật liệu kiểm tra chất lượng (QC- Quality Control material) được chạy cùng với bệnh phẩm trong mỗi lần làm xét nghiệm định lượng HVA và VMA trong nước tiểu. 2.2. Các thực nghiệm đánh giá kỹ thuật Xác định giới hạn phát hiện: Tiến hành pha loãng 2, 4, 8, 16, 32 và 64 lần dung dịch chuẩn có nồng độ cao nhất bằng HCl 0,2 M (dung môi dùng pha chuẩn). Các chuẩn pha loãng được chạy 5 lần trong một đợt phân tích theo quy trình chuẩn (standard operation pro- cedures- SOP), tính SD và CV tại các nồng độ để xác định nồng độ thấp nhất định lượng được có độ chính xác chấp nhận (giới hạn phát hiện). Thực nghiệm đánh giá độ tuyến tính: Chuẩn bị hai hỗn hợp nước tiểu của bệnh nhân. Hỗn hợp thứ nhất là các mẫu đã phân tích có nồng độ thấp. Hỗn hợp thứ hai là các mẫu đã phân tích có nồng độ cao gần với hoặc cao hơn giá trị trên dự đoán của khoảng phân tích. Trộn hai mẫu bệnh phẩm trên với các tỷ lệ như sau 1/0, 3/1, 1/1, 1/3 và 0/1. Tiến hành phân tích định lượng HVA và VMA trong 5 mẫu trên. Mỗi mẫu làm lặp lại 03 lần. Tính giá trị trung bình thu được của mỗi mẫu. Vẽ đồ thị để đánh giá độ tuyến tính bằng phần mềm Linchecker của Philippe Marquis: trục hoành là nồng độ tính toán lý thuyết, trục tung là nồng độ trung TCNCYH 82 (2) - 2013 3 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC bình đo được. Tính toán độ dốc (slope) và giao điểm với trục Y (intercept). So sánh độ dốc và giao điểm tính toán được với độ dốc và giao điểm mong muốn (là 1 và 0,0). Xác định độ chính xác: Hai loại vật liệu kiểm tra chất lượng (QC) bình thường và bệnh lý được phân tích trong một lần chạy, mỗi mẫu được chạy 15 lần (n = 15) để thu thập dữ liệu và đánh giá độ chính xác trong một lần chạy. Hai loại QC nước tiểu bình thường và bệnh lý được chạy trong 20 mẻ khác nhau trong vòng 3 tháng (n = 20). Tính giá trị trung bình, độ lệch chuẩn, và CV để đánh giá độ chính xác trong một lần chạy và giữa các lần chạy. Tiêu chuẩn chấp nhận: Độ chính xác trong một lần chạy: SD < 0,25 sai số toàn bộ cho phép. Độ chính xác giữa các lần chạy: SD < 0,33 sai số toàn bộ cho phép. Thực nghiệm so sánh phương pháp: Các vật liệu ngoại kiểm amin sinh học của chương trình ngoại kiểm Úc (RCPA) được chạy trong vòng 6 tháng liên tục: mỗi tháng 02 mẫu tuyến tính và 01 mẫu bệnh phẩm ngoại kiểm. Kết quả được so sánh với trung bình và SD của ngoại kiểm. Độ lệch (bias) của mỗi giá trị so với trung bình chung của ngoại kiểm được biểu diễn dưới dạng đồ thị để đánh giá độ lệch hệ thống (systemic bias) và độ không xác thực (inaccuracy). Đạo đức nghiên cứu: Nghiên cứu được chấp thuận bởi Hội đồng Y đức bệnh viện Nhi Trung ương. III. KẾT QUẢ Hình 1. Sắc ký đồ tổng số chạy bằng phương pháp SIM Với chương trình chạy sắc ký khí như sau: nhiệt độ lò ban đầu là 160oC, tốc độ tăng nhiệt giai đoạn đầu là 8oC/phút, tiếp theo là 50oC/phút, tổng thời gian phân tích cho một mẫu là 15,8 phút; kết quả sắc ký đồ (hình 1) cho thấy nội chuẩn có thời gian lưu là 4,95, HVA là 9,13 và VMA là 10,6 phút. Khi qua detector khối phổ, với cơ chế ion hóa bằng điện (electron impact mass spectrometry), nội chuẩn và các chất cần phân tích bị bắn phá thành các mảnh ion đặc trưng. Trong phương pháp này, nội chuẩn và hai chất cần phân tích được lựa chọn một mảnh ion đích và một ion định lượng. Tại nồng độ pha loãng thấp nhất của HVA và VMA là 0,9 µmol/L, CV lần lượt là 5,9% và 6,3%, như vậy có thể xem 0,9 µmol/L là giới hạn phát hiện của HVA và VMA. 4 TCNCYH 82 (2) - 2013 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Hình 2. Đồ thị tuyến tính của HVA (a) và MA (b) Phương trình thể hiện mối tương quan giữa nồng độ HVA đo được với nồng độ HVA tính toán theo lý thuyết là y= 0,998 x – 0,3985. Như vậy, độ dốc là 0,998 và giao điểm với trục tung là - 0,3985. Khoảng nồng độ HVA trong thử nghiệm đánh giá độ tuyến tính là từ 5,68 đến 192,9 µmol/L. Phương trình thể hiện mối tương quan giữa nồng độ VMA đo được với nồng độ VMA tính toán theo lý thuyết là y = 0,9974 x + 0,2151. Như vậy, độ dốc là 0,9974 và giao điểm với trục tung là 0,2151. Khoảng nồng độ VMA trong thử nghiệm đánh giá độ tuyến tính là từ 3,2 đến 221 µmol/L. Bảng 1. Độ chính xác của phương pháp Mẫu HVA VMA QC mức 1 QC mức 2 QC mức 1 QC mức 2 Độ chính xác trong một lần chạy (n = 15) (µmol/L) 10,9 87,8 18,2 90,6 SD 0,27 1,06 0,54 1,61 CV (%) 2,45 1,2 2,97 1,79 Độ chính xác giữa các lần chạy (n = 20) (µmol/L) 10,2 84,7 16,9 85,4 SD 0,37 1,77 0,75 2,48 CV (%) 3,6 2,1 6,6 2,6 X X Độ biến thiên (CV) trong một lần chạy của cả hai thông số HVA và VMA đều dưới 5%. Độ biến thiên (CV) giữa các lần chạy của HVA đều nhỏ hơn 5%. Với VMA, CV của QC mức 1 là 6,6%, của QC mức 2 nhỏ hơn 5%. B A TCNCYH 82 (2) - 2013 5 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Intercept : 0.0 [ -5.4 to 5.4 ] Slope : 0.971 [ 0.898 to 1.043 ] Unweighted linear regression N = 12 0 20 40 60 80 100 120 Ngoai kiem 0 20 40 60 80 100 120 GCMS Intercept : 1.4 [ -5.7 to 8.4 ] Slope : 1.021 [ 0.936 to 1.107 ] Unweighted linear regression N = 6 0 40 80 120 160 200 Ngoai kiem 0 40 80 120 160 200 GCMS A B Hình 3. Đồ thị so sánh kết quả của các mẫu HVA tuyến tính (a) và bệnh phẩm (b) với kết quả ngoại kiểm Trong vòng 6 tháng, 12 mẫu ngoại kiểm HVA tuyến tính của chương trình ngoại kiểm các amin sinh học của Úc đã được phân tích bằng phương pháp sắc ký khối phổ xây dựng tại phòng xét nghiệm. Kết quả cho thấy, không có mẫu nào ở ngoài giới hạn cho phép. Đồ thị có độ dốc là 0,971 và giao điểm là 0. Các thông số tính toán độ chính xác là: SD = 4, CV = 6,4%. Thông số tính toán độ xác thực là độ lệch (bias) = 1,9. Sáu mẫu ngoại kiểm HVA bệnh phẩm (nước tiểu của bệnh nhân) của chương trình ngoại kiểm các amin sinh học của Úc đã được phân tích bằng phương pháp GCMS xây dựng tại phòng xét nghiệm. Kết quả cho thấy không có mẫu nào ở ngoài giới hạn cho phép. Đồ thị có độ dốc là 1,021 và giao điểm là 1,4. Các thông số tính toán độ chính xác là: SD = 4,2, CV = 4,7%. Thông số tính toán độ xác thực là độ lệch (bias) = 3,2. IV. BÀN LUẬN Phương pháp định lượng HVA và VMA được phát triển dựa trên phương pháp kinh điển để xác định thành phần của acid hữu cơ niệu: chiết tách bằng ethyl acetate/tạo dẫn xuất trimethylsilyl/phân tách và định lượng HVA và VMA được thực hiện bằng phương pháp SIM (selected ion monitoring) trên máy sắc ký khối phổ. Đường chuẩn được chạy mỗi lần với các mẫu thử và được đánh giá tính hợp thức bằng vật liệu kiểm tra chất lượng (QC hai mức của Bio- Rad). Kết quả của các mẫu bệnh phẩm chỉ chấp nhận được khi QC nằm trong giới hạn cho phép. Phương pháp định lượng đồng thời HVA và VMA bằng sắc ký khối phổ là kỹ thuật được thực hiện lần đầu tiên tại phòng xét nghiệm (in-house develop- ment), do vậy cần phải được đánh giá trước khi đưa vào sử dụng. Các thực nghiệm nhằm đánh giá các sai số của phương pháp. Phương pháp có thể chấp nhận được khi các sai số không ảnh hưởng đến việc phân tích diễn giải kết quả xét nghiệm, không ảnh hưởng đến việc chẩn đoán và theo dõi điều trị bệnh. Giá trị 0,9 µmol/L có thể xem là giới hạn định lượng của HVA và VMA trong phương pháp này. Nghiên cứu của Kaluzna và cộng sự có giới hạn định lượng của HVA là 1,26 µmol/L, VMA là 0,76 µmol/L [4]. Khoảng tuyến tính của HVA được xác định là 5,36 - 194 µmol/L, VMA là 3,2 - 222 µmol/L. Độ dốc của cả hai đồ thị đều xấp xỉ 1 và giao điểm xấp xỉ 0 (hình 2). Như vậy, khoảng tuyến tính của hai thông số định lượng trong phương pháp này bao phủ cả vùng các giới hạn có ý nghĩa quyết định chẩn đoán bệnh. 6 TCNCYH 82 (2) - 2013 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Thực nghiệm xác định độ chính xác cho phép đánh giá sai số ngẫu nhiên của phép phân tích. Thực nghiệm xác định độ chính xác của phương pháp định lượng HVA và VMA bằng sắc ký khối phổ được tiến hành trên hai mẫu vật liệu kiểm tra chất lượng: QC mức 1 có nồng độ HVA và VMA nằm trong giới hạn bình thường và QC mức 2 có nồng độ hai thông số này ở mức bệnh lý. Kết quả bảng 1 cho thấy độ biến thiên (CV) trong một lần chạy và giữa các lần chạy của hai mức đều đạt tiêu chuẩn. Căn cứ vào tiêu chuẩn mong muốn cho xét nghiệm định lượng HVA và VMA niệu của Ricos và cộng sự [4], thì CV < 11,1 %, sai số toàn bộ cho phép là < 31,3%. CV của thông số HVA trong một lần chạy với hai mức QC 1 và 2 lần lượt là 2,45% và 1,2%, đều nhỏ hơn 0,25 lần sai số toàn bộ cho phép (0,25 x 31,3% = 7,825%). CV của thông số HVA giữa các lần chạy với hai mức QC 1 và 2 lần lượt là 3,6% và 2,1 %, đều nhỏ hơn 0,33 lần sai số toàn bộ cho phép (0,33 x 31,3% = 10,4%). Tương tự, CV của thông số VMA trong một lần chạy với hai mức QC 1 và 2 lần lượt là 2,97% và 1,97%, đều nhỏ hơn 0,25 lần sai số toàn bộ cho phép (0,25 x 31,3 = 7,825%). CV của thông số VMA giữa các lần chạy với hai mức QC 1 và 2 lần lượt là 6,6% và 2,6 %, đều nhỏ hơn 0,33 lần sai số toàn bộ cho phép (0,33 x 31,3% = 10,4%). Như vậy, độ chính xác của xét nghiệm định lượng HVA và VMA bằng sắc ký khối phổ ở các giá trị có ý nghĩa lâm sàng là chấp nhận được. Thực nghiệm so sánh phương pháp được tiến hành để đánh giá độ không xác thực (inaccuracy) hay sai số hệ thống. Nghiên cứu này đã tiến hành phân tích các mẫu ngoại kiểm amin sinh học của Úc bằng phương pháp được xây dựng tại phòng xét nghiệm. Tuy nhiên, do trong chương trình ngoại kiểm amin sinh học không có thông số VMA nên chỉ có HVA được xem xét và đánh giá. Với 12 mẫu ngoại kiểm HVA tuyến tính, không có mẫu nào ở ngoài giới hạn cho phép. Đồ thị so sánh giữa phương pháp sắc ký khối phổ với các giá trị trung vị của ngoại kiểm có độ dốc là 0.971 và giao điểm là 0. Các thông số tính toán độ chính xác là: SD = 4, CV = 6,4%. Thông số tính toán độ xác thực là độ lệch = 1,9. Như vậy sai số toàn bộ tính toán cho các mẫu HVA tuyến tính là: độ lệch + 3 x SD = 1,9 + 3 x 4 = 13,9, nhỏ hơn sai số toàn bộ cho phép của xét nghiệm định lượng HVA niệu là 31,3. Với 6 mẫu ngoại kiểm HVA bệnh phẩm (nước tiểu của bệnh nhân), không có mẫu nào kết quả ở ngoài giới hạn cho phép. Đồ thị so sánh giữa phương pháp sắc ký khối phổ với các giá trị trung vị của ngoại kiểm có độ dốc là 1,021 và giao điểm là 1,4. Các thông số tính toán độ chính xác là: SD = 4,2, CV = 4,7%. Thông số tính toán độ xác thực là độ lệch = 3,2. Như vậy sai số toàn bộ tính toán cho các mẫu HVA bệnh phẩm là: độ lệch + 3 x SD = 3,2 + 3 x 4,2 = 15,8, nhỏ hơn sai số toàn bộ cho phép của xét nghiệm định lượng HVA niệu là 31,3 [5]. Như vậy, phương pháp định lượng HVA và VMA niệu bằng GCMS được chuẩn hoá tại phòng xét nghiệm là hoàn toàn có thể chấp nhận được cả về độ chính xác và độ xác thực. V. KẾT LUẬN Quy trình kỹ thuật định lượng đồng thời VMA và HVA niệu bằng phương pháp sắc ký khối phổ: chiết tách HVA và VMA bằng ethyl acetate/ tạo dẫn xuất trimethylsilyl/ sử dụng hệ thống sắc ký khối phổ để phân tách và định lượng. Các thực nghiệm hiệu chuẩn qui trình kỹ thuật định lượng đồng thời VMA và HVA niệu bằng phương pháp sắc ký khối phổ cho thấy phương pháp được thực hiện cho kết quả chính xác và xác thực, có thể sử dụng để TCNCYH 82 (2) - 2013 7 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC phục vụ chẩn đoán và theo dõi điều trị u nguyên bào thần kinh. Lời cảm ơn Xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới Ban giám đốc bệnh viện Nhi Trung ương, Hiệp hội Hoá sinh lâm sàng châu Á Thái Bình Dương, TS. Ronda Greaves - Giảng viên Trường đại học RMIT, đã hỗ trợ kinh phí và kỹ thuật cho nghiên cứu này. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Fauler G., Leis H.J, Huber E., Schel- lauf Ch et al (1997). Detarmination of ho- movanillic acid and vanillylmandelic acid in neuroblastoma Screening by Stable Isotope Dilution GCMS. Journal of mass spectrometry. 32, 507 - 514. 2. Allenbrand R. and Garg U. (2010). Quantitation of Homovanillic acid (HVA) and Vanillylmandelic acid (VMA) in urine using Gas chromatography- Mass spectrometry (GCMS). Clinical Applications of Mass Spec- trometry, Method in Molecular Biology. 603, 261- 269. 3. James O. Westgard, Elsa F. Quam, Patrici L. Brarry, Sharon S. Ehrmeyer (1999). Basic method validation. WesTgard QC. 4. Kaluzna-Czaplinska J, Socha E, Rynkowski J (2010). Determinnation of homovanillic acid and vanillulandelic acid in urine of autistic children by gas chromatogra- phy/mass spectrometry. Med Sci Monit. 16(9), 445 - 450. 5. Ricos C, Alvarez V, Cava F, Garcia- Lario JV, Hernandez A, Jimenez CV, Minchinela J, Perich C, Simon M (1999). Desirable specifications for Total Error, Impre- cision, and Bias, derived from intra – and inter – individual biologic variation. Scand J Clin Lab Invest. 59, 491 - 500. Summary QUANTITATION OF URINARY HOMOVANILLIC ACID (HVA) AND VANILLYLMANDELIC ACID (VMA) BY GAS CHROMATOGRAPHY - MASS SPECTROMETRY Elevated levels of HVA and VMA in urine are often indicated as the presence of neural crest derived tumors such as neuroblastoma in children and ganglioneuroma in adults. A simple method of measuring urine HVA and VMA levels simultaneously would reduce the time and cost of diagnosis and treatment of these neural crest derived tumors. The aim of this study was to de- velop and validate a method to measure the concentrations of HVA and VMA simultaneously by GCMS. We have successfully developed a rapid and simple method for simultaneously quantizing the concentrations of HVA and VMA in urine using GCMS. Urine samples were collected and HVA and VMA were extracted and derived into their respective di- and tri(trimethylsilyl) derivatives. The derivatives were separated and quantified by SIM (Selected Ion Monitoring) on GCMS system. The measuring limits for measuring both HVA and VMA in urine by GCMS were 0.9µmol/L. The linearity range of HVA was 5.68 to 192.9 µmol/L and of VMA was 3.2 to 221 µmol/L. The calculated total errors were smaller than the acceptable total values. Therefore, this method allows clinicians to measurea accurately the concentrations of urinary VMA and HVA simultaneously using GCMS. This simple technique can be applied to the routine diagnosis and treatment moni- toring of neuroblastoma. Keywords: homovanillic acid (HVA), vanillylmandelic acid (VMA), Gas chromatography mass spectrometry(GCMS), Neuroblastoma