Vi sinh vật thực phẩm - Chương 6: Một số phương pháp xác định vi sinh vật - Trần Thị Huyền

MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH VI SINH VẬT I. HOAÙ CHAÁT VAØ MOÂI TRÖÔØNG PHAÂN TÍCH VI SINH VAÄT - Trong phân tích, kiểm nghiệm vi sinh vật, môi trường cần cho việc tăng sinh, phân lập, phân biệt, cấy chuyền, bảo quản, định danh vi sinh vật - Môi trường cần chứa đầy đủ các thành phần về nguồn carbon, đạm, khoáng đa lượng và vi lượng và có các điều kiện lý hoá phù hợp I. HOAÙ CHAÁT VAØ MOÂI TRÖÔØNG PHAÂN TÍCH VI SINH VAÄT Phân loại: * Theo bản chất - Tự nhiên - Tổng hợp - Bán tổng hợp * Theo trạng thái vật lý - Lỏng (Brothe) - Rắn - Bán lỏng (bán rắn) * Theo mục đích - Môi trường tiền tăng sinh - Môi trường tăng sinh: - Môi trường chọn lọc - Môi trường phân biệt - Môi trường thử nghiệm sinh hóa II. KỸ THUẬT LẤY MẪU, VẬN CHUYỂN VÀ BẢO QUẢN MẪU 1. Những điểm cần lưu ý: - Mẫu được lấy phải mang tính đại diện - Tránh sự tạp nhiễm vi sinh vật ngoại lai. -Mẫu chưa sử dụng phải được bảo quản ở nhiệt độ -20oC cho đến khi phân tích. Mẫu không thể bảo quản đông thì bảo quản ở nhiệt độ 0-4.4oC. - Mẫu phải được xét nghiệm trong vòng 36h, mẫu không thể đông lạnh cần xét nghiệm trong vòng 6 h. - VSV có thể bị tổn thương, trong nhiều trường hợp cần giai đoạn tăng sinh. - Cần ghi chú mẫu II. KỸ THUẬT LẤY MẪU, VẬN CHUYỂN VÀ BẢO QUẢN MẪU 2. Kế hoạc lấy mẫu: Một kế hoạch lấy mẫu chi tiết cần có các yếu tố sau: n, c, m, M - Giới hạn vsv, m & M + Chấp nhận (< m) + Ngưỡng lân cận giới hạn (> m và < M) + Không chấp nhận (> M); - Số mẫu rơi vào trong mỗi khoảng giới hạn vsv (c) (có nghĩa là chấp nhận/lân cận/không chấp nhận). II. KỸ THUẬT LẤY MẪU, VẬN CHUYỂN VÀ BẢO QUẢN MẪU 2. Kế hoạc lấy mẫu: * Kế hoạch hai thuộc tính - Chỉ nêu ra m - Nếu tất cả các mẫu m hoặc c mẫu trong số n mẫu thử >m thì chấp nhận lô hàng, nếu >c mẫu trong số n mẫu thử >m thì từ chối lô hàng * Kế hoạch ba thuộc tính - Đặt ra cả m và M - Chỉ tiêu “m” thường phản ánh ngưỡng trên của GMP - Chỉ tiêu “M” đánh dấu giới hạn trên đó sự ô nhiễm là nguy hiểm và không chấp nhận được - Nếu tất cả các mẫu m hoặc c mẫu trong số n mẫu thử nằm trong khoảng >m và M thì chấp nhận lô sản phẩm. Nếu >c mẫu trong số n mẫu thử nằm trong khoảng > m và M hoặc có một mẫu >M thì từ chối lô sản phẩm II. KỸ THUẬT LẤY MẪU, VẬN CHUYỂN VÀ BẢO QUẢN MẪU 2. Kế hoạc lấy mẫu: * Lựa chọn kế hoạch lấy mẫu - Kế hoạch hai thuộc tính: đối tượng vsv quan tâm không được phép có trong thực phẩm. - Nếu cho phép một số lượng nhất định vsv trong một đơn vị thể tích thì thường sử dụng kế hoạch ba thuộc tính. II. KỸ THUẬT LẤY MẪU, VẬN CHUYỂN VÀ BẢO QUẢN MẪU 3. Thu và vận chuyển mẫu - Thu tại nhiều thời điểm và vị trí. Đối với loại thực phẩm đã biết chỉ nhiễm bề mặt thì cần dùng que bông vô trùng quét một diện tích bề mặt nhất định hoặc cắt lát với bề dày 2-3 mm để thu mẫu - Dụng cụ chứa bằng bình nhựa có nắp (tránh sử dụng dụng cụ thủy tinh dễ vỡ) - Chú ý nhiệt độ và thời gian vận chuyển, bảo quản mẫu (còn tuỳ đặc điểm của thực phẩm) II. KỸ THUẬT LẤY MẪU, VẬN CHUYỂN VÀ BẢO QUẢN MẪU - Các sản phẩm lạnh đông: Mẫu được lau cồn phía ngoài bao PE, đặt vào khay tráng men đã vô trùng, đưa vào buồng vô trùng để rã đông tự nhiên ở nhiệt độ phòng, hoặc giải đông ở 2-5oC trong 18 h; hoặc 45oC trong 15 phút nếu cần. - Đối với mẫu đồ hộp: Phải kiểm tra dạng bên ngoài xem hộp có bị phồng, biến dạng, bị hở các mối ghép hay khôn. Lau chùi bằng cồn phía ngoài, đưa vào phòng vô trùng để kiểm. - Đối với các sản phẩm bao bì bằng thủy tinh, bao nylon phải kiểm tra độ kín của bao bì, chùi cồn phía ngoài, đưa vào phòng vô trùng để kiểm II. KỸ THUẬT LẤY MẪU, VẬN CHUYỂN VÀ BẢO QUẢN MẪU 4. Chuẩn bị mẫu phân tích - Đối với các sản phẩm đặc hoàn toàn: Cân 10 g (hoặc 25 g) mẫu cho vào cối sứ nghiền nát, bỏ vào erlen 150 ml có sẵn bi thủy tinh vô khuẩn hay nước cất đã tiệt trùng. Lắc đều, để lắng cặn. Hút phần dịch để cấy mẫu, ta có độ pha loãng 10-1. - Đối với các sản phẩm vừa đặc, vừa lỏng: cân 10-100 g mẫu (cả cái lẫn nước) cho vào cối nhỏ vô trùng nghiền. Cân 10 g đã nghiền nát cho vào erlen 250 ml có 90 ml dung dịch nước muối sinh lý có bi thủy tinh, lắc đều, để lắng cặn. Hút phần dịch để cấy mẫu, ta có độ pha loãng 10-1. - Đối với các sản phẩm lỏng hoàn toàn: Có thể hút trực tiếp mẫu hoặc pha loãng tuỳ theo mức độ nhiễm bẩn. Lắc kỹ. Hút 10 ml mẫu cho vào erlen 250 ml đã có sẵn 90 ml nước cất hay nước muối sinh lý tiệt khuẩn. Ta có độ pha loãng 10-1. - Dung dịch pha loãng: tốt hơn nên dùng nước peptone 0.1%, nước muối sinh lý (0.85%), trong buffer nếu cần. III. THỬ NGHIỆM SINH HOÁ Trong kỹ thuật phân tích vi sinh vật, việc định danh vi sinh vật được thực hiện dựa vào các đặc điểm về kiểu hình và các phản ứng sinh hoá thực hiện bởi các chủng vi sinh vật. Các phản ứng sinh hoá có thể tiến hành theo một trong ba cách là cách truyền thống, sử dụng bộ KIT và dùng thiết bị tự động. Trong kiểm nghiệm, phân tích, các kết quả thử nghiệm sinh hoá biểu thị quy ước bằng các ký hiệu như: (+): dương tính (-): âm tính (+/-): khoảng trên 70% là dương tính (-/+): khoảng trên 70% là âm tính. III. THỬ NGHIỆM SINH HOÁ 3.1.1. Thử nghiệm khả năng lên men - Xác định khả năng sử dụng một nguồn carbon nhất định bởi vi sinh vật để tăng trưởng theo con đường lên men. - Sản phẩm tạo thành làm giảm pH môi trường làm thay đổi màu môi trường - CO2 tạo ra, được bẫy bằng ống Durham, làm nổi ống. - Môi trường sử dụng: + Phenol Red Broth Base: đỏ (pH 7,4)vàng (pH 6,8): có nguồn Carbon tuỳ theo vi sinh vật - Dùng để định danh các vi sinh vật thuộc hộ Enterobacteriacea (vi sinh vật đường ruột) + E.coli, Klebsiella, Staphylococcus: + + Corynebacterium: - III. THỬ NGHIỆM SINH HOÁ 3.1.1. Thử nghiệm khả năng lên men + + - - III. THỬ NGHIỆM SINH HOÁ 3.1.2. Thử nghiệm khả năng oxy hoá-lên men (Thử nghiệm Hugh-Leifson) - Thử nghiệm nhằm xác định vi sinh vật biến dưỡng carbon hydrat theo con đường lên men hay hô hấp - Môi trường Hugh-Leifson chứa chỉ thị pH là bromothymol blue -Thử nghiệm gồm 2 ống môi trường; một ống được phủ paraffin lên bề mặt môi trường. Cấy đâm sâu vi sinh vật vào môi trường - Lên men: 2 ống bị acid hoá từ trên mặt xuống đáy môi trường -Hô hấp: ống kỵ khí bị acid hoá đều hết môi trường, ống hiếu khí bị acid hoá chỉ ở phần đáy III. THỬ NGHIỆM SINH HOÁ 3.1.2. Thử nghiệm khả năng oxy hoá-lên men (Thử nghiệm Hugh-Leifson) Hô hấp III. THỬ NGHIỆM SINH HOÁ 3.1.3. Thử nghiệm Bile Esculin - Thử nghiệm phân biệt vi sinh vật dựa trên khả năng thuỷ phân liên kết glucoside trong esculin thành esculentin và glucose. - Esculentin phản ứng với muối sắt tạo phức hợp màu nâu hay đen - Môi trường: Aesculin Medium hay Edwards - Sau phản ứng: + hoá nâu hay đen: + + Không đổi màu: - III. THỬ NGHIỆM SINH HOÁ 3.1.3. Thử nghiệm Bile Esculin + - III. THỬ NGHIỆM SINH HOÁ 3.1.4. Thử nghiệm khả năng biến dưỡng citrate - Xác định khả năng sử dụng citrat làm nguồn carbonhydrat duy nhất của vi sinh vật. Ở những chủng có đặc tính này , sẽ có khả năng dùng muối amonium - Sản phẩm tạo thành là NH3 làm kiềm hoá môi trườngthay đổi màu của môi trường. - Môi trường Simmons citrat agar chứa chỉ thị bromothymol blue, xanh lục (pH trung tính), xanh dương (pH>7,6) - Sau phản ứng: + xanh lục: - + Xanh dương: + III. THỬ NGHIỆM SINH HOÁ 3.1.4. Thử nghiệm khả năng biến dưỡng citrate + - III. THỬ NGHIỆM SINH HOÁ 3.1.5. Thử nghiệm khả năng biến dưỡng malonate - Xác định khả năng sử dụng malonat làm nguồn carbon duy nhất. Ở những chủng có đặc tính này , sẽ có khả năng dùng muối amonium - Sản phẩm tạo thành là NH3 làm kiềm hoá môi trườngthay đổi màu của môi trường. - Môi trường Malonate Broth chứa chỉ thị bromothymol blue, xanh lục (pH trung tính), xanh dương (pH>7,6) - Sau phản ứng: + xanh lục: - + Xanh dương: + III. THỬ NGHIỆM SINH HOÁ 3.1.5. Thử nghiệm khả năng biến dưỡng malonate + - III. THỬ NGHIỆM SINH HOÁ 3.1.6. Thử nghiệm catalase - Dùng để phân biệt vi sinh vật hiếu khí và với sinh vật kỵ khí - Vi sinh vật hiếu khí có enzym catalase, có khả năng phân giải H2O2 (chất rất độc đối với tế bào) thành H2O và O2. - Hoá chất: H2O2 30% được giữ lạnh. -Nhỏ một giọt sinh khối vi sinh vật lên một giọt H2O2. + Nếu có sự sủi bọt (O2 sinh ra)vi sinh vật hiếu khí. Vi dụ: Bacillus, Micrococcus, Staphylococcus + Không suất hiện bọt khí, vi sinh vật kỵ khí. Ví dụ: Clostridium, Streptococcus III. THỬ NGHIỆM SINH HOÁ 3.1.6. Thử nghiệm catalase - + + - III. THỬ NGHIỆM SINH HOÁ 3.1.7. Thử nghiệm decarboxylase - Thử nghiệm dùng để phân loại và định danh các loại vi khuẩn đường ruột, dựa trên loại enzym decarboxylase xúc tác phản ứng phân giải một acid amin đặc trưng, tạo CO2 làm tăng pH môi trường - Có 3 loại enzym decarboxylase: ODC, LDC, ADC (ADH) - Môi trường Decarboxylase Basal Medium, chứa chỉ thị vàng bromocresol purple, pH 6 và một loại acid amin đặc trưng (ornithin, lysin, arginin) - Sau phản ứng: + Màu vàng: - + Môi trường trở nên đục và có màu tím: + III. THỬ NGHIỆM SINH HOÁ 3.1.7. Thử nghiệm decarboxylase -+ III. THỬ NGHIỆM SINH HOÁ 3.1.8. Thử nghiệm coagulase - Thường dùng để định danh Staphylococcus. Loài này có khả năng tiết enzym coagulase có tác dụng làm kết tụ các thành phần huyết tương, tạo khối đông huyết tương - Thử nghiệm được thực hiện với huyết tương thỏ hay người dạng đông khô - Thử nghiệm được tiến hành trên phiến kính hay trong ống nghiệm - Sau phản ứng (khoảng 4 phút): + Xuất hiện đám ngưng kết trong vòng 20 giây: + + Không có phản ứng ngưng kết: - III. THỬ NGHIỆM SINH HOÁ 3.1.8. Thử nghiệm coagulase + - III. THỬ NGHIỆM SINH HOÁ 3.1.9. Thử nghiệm urease - Thử nghiệm dùng để xác định khả năng tạo enzym urease của một số chủng vi sinh vật, nhất là nhóm Proteus. - Enzym này xúc tác phản ứng phân giải urê thành NH3 và CO2 làm tăng pH của môi trường - Môi trường: môi trường lỏng Rustigian-Stuart’s Urea Broth hay môi trường đặc Christensen Urea chứa chỉ thị đỏ phenol. - Sau phản ứng: + Không đổi màu (màu vàng cam): - + Chuyển thành màu đỏ tím: + III. THỬ NGHIỆM SINH HOÁ 3.1.9. Thử nghiệm urease - ++++++ III. THỬ NGHIỆM SINH HOÁ 3.1.10. Thử nghiệm gelatinase -Thử nghiệm dùng để đánh giá khả năng tiết enzym gelatinase phân giải gelatine thành polypeptid và acid amin. - Môi trường nuôi cấy VSV được bổ sung gelatine hoặc nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường có gelatine sau đó bổ sung 5-10ml trichloacetic acid TCA để là kết tủa gelatine. - Sau phản ứng: + Ống nghiệm thạch nghiêng bị tan chảy: + + Không thay đổi trạng thái: - - Chủng vi sinh vật: Aeromonas hydrophyla (+), E. coli (-) III. THỬ NGHIỆM SINH HOÁ 3.1.10. Thử nghiệm gelatinase + - III. THỬ NGHIỆM SINH HOÁ 3.1.11. Thử nghiệm khả năng sinh H2S -Thử nghiệm dùng để xác định khả năng phân giải các acid amin chứa lưu huỳnh (cystein, cystin, methionin) sinh H2S nhờ enzym desulfuahydrase. -H2S sinh ra sẽ tạo tủa màu đen với chỉ thị sulfide (Fe II, III, amonium sulfat sắt) chứa trong môi trường -Môi trường thử nghiệm: KIA, TSI, SIM, PIA, BSA -Sau nuôi cấy: + Xuất hiện màu đen trong môi trường: + + Không xuất hiệ màu: - - Vi sinh vật: E.coli (+), Klebsiella (-), Proteus mirabilis (-) III. THỬ NGHIỆM SINH HOÁ 3.1.11. Thử nghiệm khả năng sinh H2S III. THỬ NGHIỆM SINH HOÁ 3.1.12. Thử nghiệm khả năng sinh idol - Thử nghiệm dùng để xác định khả năng chuyển hoá các sản phẩm trung gian của quá trình oxy hoá thành indol - Indol được xác định nhờ phản ứng với thuốc thử p- dimethylaminobenzaldehide tạo phức hợp dạng qiunon có màu đỏ - Môi trường thử nghiệm: nước tripton, MIU, SIM. Thuốc thử phát hiện indol là Kovacs và Erlich - Sau phản ứng: + Xuất hiện lớp màu đỏ trên bề mặt môi trường: + + không xuất hiện lớp màu: - - Vi sinh vật: E.coli (+), Klebsiella (-), Serratia marcescen (-), Proteus rettgeri (+) III. THỬ NGHIỆM SINH HOÁ 3.1.12. Thử nghiệm khả năng sinh idol - + 3.1.12. Thử nghiệm khả năng sinh idol III. THỬ NGHIỆM SINH HOÁ 3.1.13. Thử nghiệm KIA, TSI - Môi trường KIA, TSI sử dụng đồng thời để thử nghiệm sử dụng các nguồn carbon khác nhau (glucose, lactose) và khả năng sinh H2S. - KIA chứa 1% lactose, 0,1% glucose (chất chỉ thị đỏ phenol). Môi trường TSI có thành phần tương tự KIA, chỉ thêm 1% succrose. - Trên KIA: + Nếu chỉ lên men glucosetrên mặt có màu đỏ, phần sâu có màu vàng. + Nếu sử dụng cả glu và lac môi trường không đổi màu, nếu nuôi cấy lâu, bề mặt chuyển màu đỏ + không sử dụng cả hai loại đườngbề mặt có màu đỏ, phân sâu không có màu - Nếu sự lên men tạo khí sẽ tích tụ và làm vỡ thạch - Thử nghiệm H2S được thực hiện nhờ sodium thiumsulphate trong thành phần môi trường, H2S được nhận biết nhờ sắt amonium citrat III. THỬ NGHIỆM SINH HOÁ 3.1.13. Thử nghiệm KIA, TSI III. THỬ NGHIỆM SINH HOÁ 3.1.14. Thử nghiệm nitratase (khử nitrate) - Thử nghiệm dùng để kiểm tra đặc tính sử dụng enzym nitratase để khử nitrat thành nitrite và các sản phẩm khác -Nitrite tạo thành sẽ được nhận biết nhờ phản ứng với sulphanilamide và N-napthylethylenediamide hydrochloride ở pH acid cho phức chất màu hồng. - Môi trường: Nitrate Broth, sodium nitrate - Sau phản ứng: khi thêm thuốc thử vào và acid hoá môi trường + xuất hiện màu hồng: + + Không xuất hiện phức màu: - III. THỬ NGHIỆM SINH HOÁ 3.1.14. Thử nghiệm nitratase (khử nitrate) III. THỬ NGHIỆM SINH HOÁ 3.1.15. Thử nghiệm oxidase - Thử nghiệm nhằm xác định sự hiện diện của hệ enzym oxydase ở vi sinh vật -Hoạt tính oxydase được phát hiện nhờ thuốc thử p- phenylenediamin, nếu có sự hiện của enzym, thuốc thử bị oxy hoá mộït hợp chất indolphenol có màu xanh dương - Môi trường nuôi cấy VSV là Nutrien Agar, lấy một ít sinh khối đặt lên giấy lọc có tẩm thuốc thử - Sau thử nghiệm: + Xuất hiện màu xanh dương:+ + Không đổi màu: - III. THỬ NGHIỆM SINH HOÁ 3.1.15. Thử nghiệm oxidase III. THỬ NGHIỆM SINH HOÁ 3.1.16. Thử nghiệm ONPG - Thử nghiệm dùng để xác định hoạt tính enzym -galactosidase tham gia vào quá trình lên men lactose ở vi sinh vật. Môi trường thử nghiệm là ONPG broth chứa o-nitrophenyl-D- galactopyranoside. Sản phẩm tạo thành là o-nitrophenol có màu vàng - Vi sinh vật: Serratia marcescens (+), Proteus rettgeri (-) - Sau thử nghiệm: + Xuất hiện màu vàng: + + Không xuất hiện màu: - III. THỬ NGHIỆM SINH HOÁ 3.1.16. Thử nghiệm ONPG + - III. THỬ NGHIỆM SINH HOÁ 3.1.17. Thử nghiệm MR (Methyl Red) - Thử nghiệm nhằm phân biệt vi sinh vật dựa vào sự khác biệt trong quá trình tạo và duy trì các sản phẩm có tính acid từ sự lên men glucose. Vi sinh vật lên men glucose tạo và duy trì sản phẩm acid, làm đổi màu thuốc thử. Nếu sản phẩm acid tiếp tục biến đổi thành các sản phẩm trung tính, không làm đổi màu thuốc thử. - Chất chỉ màu pH môi trường là methyl đỏ - Môi trường thử nghiệm: môi trường MR-VP - Sau thử nghiệm: + Môi trường chuyển sang đỏ: + + Môi trường không đổi màu: - - Chủng vi sinh vật: Proteus rettgeri (+), Serratia marcescens (-) III. THỬ NGHIỆM SINH HOÁ 3.1.17. Thử nghiệm MR (Methyl Red) _ + + + III. THỬ NGHIỆM SINH HOÁ 3.1.18. Thử nghiệm VP (Voges-Proskauer) - Phản ứng dùng phân biệt các loài trong họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae, dựa vào sự oxi hoá acetoin được tạo ra từ 2,3-butanediol thành diacetyl. Diacetyl được xác định dựa vào phản ứng kết hợp với nhân guanidine của pepton tạo phức đỏ. - Môi trường thử nghiệm: Môi trường MR-VP - Thuốc thử: Barritt, Koblentz chứa  napthol và KOH - Sau thử nghiệm: + Xuất hiện màu đỏ trên mặt môi trường: + + Bề mặt môi trường không đổi màu: - - Vi sinh vật: E. coli (-), Enterobacter cloacea (+) III. THỬ NGHIỆM SINH HOÁ 3.1.18. Thử nghiệm VP (Voges-Proskauer) 3.1.18. Thử nghiệm VP (Voges-Proskauer) III. THỬ NGHIỆM SINH HOÁ 3.1.19. Thử nghiệm CAMP - Phản ứng nhằm phân biệt các nhóm Streptococcus. Phản ứng CAMP là thực hiện giữa nhân tố CAMP do Streptococcus nhóm B tiết ra và -hemolysin được tiết ra bởi Staphylococcus aureus làm tăng hoạt tính của -hemolysin gây phá vỡ hồng cầu (tan huyết) - Thử nghiệm thực hiện đồi thời giữa chủng Staph. aureus và chúng thử nghiệm. Hai đường cấy vuông góc cách nhau 1-2mm - Môi trường thử nghiệm: Tryptose Blood agar base. - Sau thử nghiệm: + Xuất hiện vùng tan huyết: + + Không xuất hiện vùng tan huyết: - - Vi sinh vật: Strep. agalactiar (-), Strep nhóm B (+) - III. THỬ NGHIỆM SINH HOÁ 3.1.19. Thử nghiệm CAMP +- III. THỬ NGHIỆM SINH HOÁ 3.1.20. Thử nghiệm tính di động