Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic khử cyanua tổng thích hợp trên môi trường bã sắn

Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2014 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 67 THOÂNG BAÙO KHOA HOÏC TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN LACTIC KHỬ CYANUA TỔNG THÍCH HỢP TRÊN MÔI TRƯỜNG BÃ SẮN SCREENING A STRAIN OF LACTIC ACID BACTERIA REDUCING TOTAL CYANIDE ON CASSAVA RESIDUAL PULP Nguyễn Minh Trí1 , Mai Thị Tuyết Nga2 , Hồ Diễm Thúy3 Ngày nhận bài: 05/11/2013 ; Ngày phản biện thông qua: 12/12/2013; Ngày duyệt đăng: 02/6/2014 TÓM TẮT: Hai bảy chủng vi khuẩn lactic có khả năng khử cyanua đã được phân lập từ bã sắn tươi lên men tự nhiên và bã sắn tươi ủ với kim chi, nem chua, tôm chua, dưa chua và sữa chua. Trong đó, chủng LB2 phân lập từ môi trường bã sắn tươi ủ với kim chi là chủng có khả năng khử cyanua tốt nhất. Môi trường bã sắn lên men có bổ sung chủng LB2 có hàm lượng cyanua tổng giảm từ 241,4 ± 5,22 mg/kg khối lượng khô xuống 73,52 ± 3,1 mg/kg khối lượng khô, hàm lượng cyanua tự do giảm từ 104 ± 3,22 mg/kg khối lượng khô xuống 32 ± 0,76 mg/kg khối lượng khô đồng thời hàm lượng cyanua trong tế bào sau 24h lên men bằng 0 μg/g. Kết quả định danh xác định chủng LB2 là Lactobacillus plantarum. Từ khóa: bã sắn, cyanua tổng, lên men lactic, vi khuẩn lactic. ABSTRAC: 27 lactic acid bacteria strains has the ability to reduce the cyanide in which were isolated from the natural fermenting fresh cassava residual pulp and fresh cassava residual pulp ensiled with kim chi, nem chua, tôm chua, dưa chua, yogurt, respectively. In there, strain LB2 were isolated from fresh cassava residual pulp ensiled with kim chi that strain is the best ability to reduce the cyanide. The fermenting fresh cassava residual pulp added strain LB2 that total cyanide content decreased from 241.4 ± 5,22 mg/kg dry weight to 73.52 ± 3.1 mg/kg dry weight, free cyanide content decreased from 104 ± 3.22mg/kg dry weight to 32 ± 0,76 mg/kg dry weight and cyanide content in cells after 24 hours of fermentation by 0 μg/g. Results of the molecular identifi cation of strain LB2 is Lactobacillus plantarum. Keywords: Cassava residual pulp, total cyanide, lactic fermentation, lactic acid bacteria 1 TS. Nguyễn Minh Trí: Trường Đại học Nha Trang 2 TS. Mai Thị Tuyết Nga: Khoa Công nghệ thực phẩm - Trường Đại học Nha Trang 3 Hồ Diễm Thúy: Cao học Công nghệ sau thu hoạch 2011 - Trường Đại học Nha Trang I. ĐẶT VẤN ĐỀ Bã sắn công nghiệp là nguồn nguyên liệu phong phú trong sản xuất thức ăn chăn nuôi. Tuy nhiên, sự tồn tại của hợp chất cyanua gây độc trong bã sắn ở dạng tự do và dạng hợp chất, chủ yếu ở dạng linamarin làm hạn chế khả năng sử dụng của nguồn nguyên liệu này. Vi khuẩn lactic sinh trưởng trên môi trường bã sắn có khả năng sinh tổng hợp enzyme linamarase là enzyme thủy phân liên kết β của linamarin tạo thành aceton cyanohydrins và glucose [20], [22], [23]. Tại pH lớn hơn 5, aceton cyanohydrin sẽ tự phá vỡ tạo aceton và hydrogen cyanide (HCN) dưới tác dụng của enzyme hydroxynitrile lyase (HNL) có mặt trong sắn [26]. Hydrogen cyanide được biến đổi thành CO2 và NH3 nhờ hệ enzyme cyanide oxygenase (sau đó NH3 được đồng hóa) [15]. Điều đó có nghĩa là khả năng giải độc cyanua của vi khuẩn lactic dựa trên khả năng tách gốc CN ¯ và chuyển hóa thành cacbon và nitơ [19]. Mặt khác, glucose giải phóng bởi quá trình thủy phân linamarin được chuyển hóa ngay lập tức thành acid lactic bởi vi khuẩn lactic [18]. Như vậy, các sản phẩm thủy phân linamarin đều được vi khuẩn lactic chuyển hóa sử dụng làm cơ chất cho sự sinh trưởng phát triển trong quá trình lên men làm tăng khả năng giải độc và bảo quản tốt Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2014 68 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG sản phẩm. Vì vậy, vi khuẩn latic được nhận định là nguồn giải độc tiềm năng. Vi khuẩn lactic chiếm ưu thế như Lactobacillus, Leuconostoc và Streptococcus được phân lập từ các nguồn thực phẩm lên men như sản phẩm sắn lên men, kim chi, dưa chua, nem chua, sữa chua [2], [3], [15]. Đây là nguồn vi sinh dồi dào cho sự lựa chọn để phát triển chủng tốt thích hợp cho quá trình khử chất độc trong bã sắn. Một số các tác giả đã phân lập một số loài vi khuẩn lactic, nấm men để xác định hoạt tính của enzyme linamarase có khả năng thủy phân linamarin [12], [23], [25]. Nhiều công trình nghiên cứu đã báo cáo về khả năng làm giảm hợp chất cyanua trong quá trình lên men lacti. [8], [16], [21], [24]. Kế thừa những thành tựu của nghiên cứu trước, nghiên cứu này được thực hiện nhằm mục đích tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có khả năng làm giảm hàm lượng cyanua tổng trong bã sắn, từ đó định hướng sử dụng bã sắn làm thức ăn chăn nuôi và góp phần làm giảm thiểu ô nhiễm môi trường. II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Vi sinh vật và môi trường nuôi cấy Các chủng vi khuẩn lactic được phân lập từ các thực phẩm lên men lactic như dưa chua, sữa chua, nem chua, tôm chua được thu thập tại Nha Trang, Khánh Hòa. Chủng vi khuẩn lactic đối chứng gồm Lactobacillus plantarum và L. acidophilus do Phòng Thí nghiệm vi sinh, Trung tâm Thí nghiệm - Thực hành - Trường Đại học Nha Trang cung cấp. Môi trường MRS được sử dụng trong phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học của vi khuẩn lactic. Hóa chất sử dụng trong phân tích là các hóa chất chuẩn, tinh khiết. Khảo sát sự giảm cyanua trong bã sắn khi ủ với thực phẩm lên men lactic: Tiến hành đồng hóa các thực phẩm lên men lactic, sau đó cấy chuyển 10 ml dịch chứa các nguồn vi khuẩn khác nhau từ sản phẩm lên men lactic tự nhiên (dưa chua, nem chua, kim chi, sữa chua,...) vào 100 g môi trường bã sắn (bã sắn tươi 98,5%, bột đậu nành 1%, muối 0,5%). So sánh sự khác nhau về hàm lượng cyanua trước và sau khi ủ bã sắn ở 30 ± 0C trong 48 giờ. 2. Phân lập, đánh giá và định danh vi khuẩn lactic Các mẫu bã sắn ủ với thực phẩm lên men lactic có hàm lượng cyanua giảm sau 48 giờ lên men sẽ được giữ lại. Tiến hành phân lập vi khuẩn lactic từ các mẫu đó trên đĩa thạch MRS. Vi khuẩ n lactic đượ c sơ bộ định danh bằ ng cá ch dựa vào phản ứng Gram, thử nghiệm catalase và hình thái trên tiêu bản nhuộm. Tiêu chuẩn xác định vi khuẩn lactic là Gram dương, không sinh bào tử, hình cầu khuẩn, trực khuẩn hoặc cầu trực khuẩn, catalase âm tính [2], [4], [5], [6], [13], [14]. Nuôi tăng sinh các chủng vi khuẩn lactic có khả năng giảm cyanua lớn nhất trên môi trường MRS lỏng, sau đó ủ trên môi trường bã sắn. Đánh giá tốc độ phát triển của chủng vi khuẩn lactic theo phương pháp đếm khuẩn lạc, dựa trên 52 TCN - TQTP 0013: 2006 [10]. Chủng vi khuẩn tuyển chọn được đinh danh bằng phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA và tra cứu trên BLAST SEARCH. Quá trì nh giải trình tự gen đượ c thự c hiệ n bở i phò ng xé t nghiệ m NK-BIOTEK, TP. HCM. 3. Xác định hàm lượng ẩm của bã sắn tươi Hàm lượng ẩm của bã sắn tươi được xác định theo TCVN 4326:2001 [11]. 4. Xác định hàm lượng cyanua trong bã sắn tươi lên men Tiến hành nuôi tăng sinh chủng lactic được tuyển chọn trong 100 ml môi trường MRS lỏng với 1,5% linamarin ở 30 ± 2 oC trong 24 giờ. Tiến hành phá vỡ tế bào vi khuẩn lactic bằng cách cho 100 ml MRS lỏng có chứa vi khuẩn lactic sau khi tăng sinh vào thiết bị đánh sóng siêu âm ở tần số 250 KHz, 2 0C trong 20 phút [17]. Xác định hàm lượng cyanua trước và sau khi phá vỡ tế bào vi khuẩn lactic [1]. Từ đó kết luận về sự tồn tại của cyanua bên trong tế bào lactic. Định lượng cyanua tổng trong các mẫu bã sắn tươi lên men ở sau 72 giờ lên men bằng cách xử lý với enzyme linamarase [7], ngâm mẫu trong nước và dùng hơi nước chưng cất lôi cuốn chuyển axit xyanhydric vào dung dịch NaOH 2,5%. Sau đó chuẩn độ dung dịch thu được bằng dung dịch AgNO3 0,02 N với sự có mặt của KI 5% [1]. 5. Xử lý thống kê Số liệu trong báo cáo là kết quả trung bình của ba lần phân tích trình bày ở dạng trung bình ± SD. Sử dụng phần mềm SPSS 18 trong thiết kế thí nghiệm, xử lý số liệu thực nghiệm (Giá trị của p < 0,05 được coi là có ý nghĩa về mặt thống kê), vẽ đồ thị bằng phần mềm Microsoft Excel. III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 1. Khảo sát sự khử cyanua của vi khuẩn lactic từ các nguồn thực phẩm lên men lactic trên môi trường bã sắn Kết quả khảo sát sự khử cyanua của vi khuẩn lactic từ các nguồn thực phẩm lên men lactic trên môi Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2014 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 69 trường bã sắn được thể hiện ở hình 1. Kết quả cho thấy: Sau 48 giờ lên men hàm lượng cyanua trong các mẫu bã sắn giảm đáng kể và hàm lượng cyanua trong mẫu bã sắn ủ với nguồn vi sinh giảm mạnh hơn mẫu bã sắn ủ tự nhiên không bổ sung nguồn vi sinh. Cụ thể là, hàm lượng cyanua tổng và tự do trong nguyên liệu bã sắn tươi là 241,4 và104 mg/kg khối lượng khô. Bã sắn ủ tự nhiên hàm lượng cyanua tổng và cyanua tự do giảm xuống 213 và 91,7 mg/kg khối lượng khô. Bã sắn ủ với nguồn vi sinh hàm lượng cyanua tổng và cyanua tự do giảm xuống thấp dao động từ 126 - 168 và 72,1 - 54,3 mg/kg khối lượng khô. Như vậy, so với nguyên liệu ban đầu, sử dụng vi sinh lên men bã sắn thì hàm lượng cyanua giảm từ 30 - 48% cao hơn bã sắn lên men tự nhiên, hàm lượng cyanua giảm 11,5%. Hình 1. Hàm lượng cyanua tổng số trong các mẫu bã sắn ủ với thực phẩm lên men lactic Các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa giữa các mẫu Như vậy, quá trình lên men chua làm giảm hàm lượng cyanua tổng và cyanua tự do. Điều đó chứng tỏ rằng, các chủng lactic từ các nguồn lên men lactic phát triển thích hợp trên môi trường bã sắn và có khả năng khử cyanua để tồn tại và phát triển. Đây chính là cơ sở để tiến hành phân lập các chủng lactic thích hợp trên môi trường bã sắn nhằm khử hàm lượng cyanua của bã sắn đến mức an toàn cho vật nuôi. 2. Phân lập chủng lactic từ bã sắn lên men lactic có giảm cyanua tổng Bảng 1. Nguồn gốc, số lượng, kí hiệu của các chủng vi khuẩn lactic được phân lập Nguồn gốc Số lượng Kí hiệu chủng Chủng vi khuẩn lactic do Phòng Thí nghiệm cung cấp 2 L. plantarum L. acidophilus Bã sắn ủ tự nhiên 3 LB15, LB16, LB17 Bã sắn ủ với kim chi 10 LB1, LB2, LB3, LB4, LB5, LB6, LB7, LB8, LB9, LB10 Bã sắn ủ với tôm chua 4 LB11, LB12, LB13, LB 14 Bã sắn ủ với nem chua 5 LB18, LB19, LB20, LB21, LB22 Bã sắn ủ với dưa chua 3 LB23, LB24, LB25 Bã sắn ủ với sữa chua 2 LB26, LB27 Bảng 2. Đặc điểm hình dạng của 8 chủng vi khuẩn lactic được lựa chọn Kí hiệu chủng Hình dạng khuẩn l ạc Hình dạng tế bào L. plantarum Tròn, trắng sữa Trực khuẩn nhỏ, kết đôi L. acidophilus Tròn, trắng đục, có màng nhầy Trực khuẩn, kết chuỗi LB16 Nhỏ, tròn, trắng đục, Trực khuẩn ngắn, kết chuỗi dài. LB2 To, trò n, bóng, màu trắng sữa Trực khuẩn ngắn (mập), kết đôi, kết chuỗi LB4 Nhỏ, tròn, trắng sữa Trực khuẩn dài, kết chuỗi LB18 Tròn, trằng đục Trực khuẩn, kết chuỗi LB 23 Tròn, trắng sữa, trong Trực khuẩn đôi, kết chuỗi dài LB27 Tròn, trằng sữa Cầu khuẩn đôi, kết chuỗi Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2014 70 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG 3. Đánh giá khả năng khử cyanua và tốc độ sinh trưởng của các chủng lactic được chọn trên môi trường bã sắn Khả năng khử cyanua tổng và chuyển hóa cyanua tự do của các chủng lactic trên môi trường bã sắn tươi sau 72 giờ lên men ở 30 ± 20C được trình bày ở hình 2. Kết quả cho thấy, hàm lượng cyanua tổng và cyanua tự do giảm trong quá trình lên men so với nguyên liệu ban đầu lên đến 69%. Quá trình khử cyanua tổng trong lên men chính là sự cắt đứt mạch của hợp chất cyanua ở dạng liên kết là linamarin, chiếm 80 - 96% và cuối quá trình lên men không phải là sự hiện diện của hợp chất này mà sản phẩm là acetone cyanohydrin và hydrogen cyanide, sau đó chúng sẽ được vi khuẩn chuyển hóa tạo thành CO2 và NH3. Hiệu suất của hai quá trình này tương đương nhau. Như vậy, tất cả các chủng được phân lập đều có khả năng sinh ra enzyme linamarase phá vỡ liên kết của linamarin và chuyển hóa axit xyanhydric trong quá trình lên men. Chủng L. plantarum, LB2, LB4, LB18, LB23, LB27 có khả năng khử cyanua tương đối tốt. Tuy nhiên, chủng LB2 có khả năng khử cyanua vượt trội nhất. Hàm lượng cyanua tổng và cyanua tự do trong bã sắn giảm xuống 73,52 và 32 mg/kg khối lượng khô. Cả hai chỉ tiêu này đều nằm trong giới hạn cho phép đối với thức ăn chăn nuôi, nhỏ hơn 100 mg/kg khối lượng khô [9]. Hình 2. Khả năng khử cyanua tổng của các chủng lactic Các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa giữa các mẫu Mặt khác, trên môi trường bã sắn lên men chủng vi khuẩn lactic LB2 còn sinh trưởng và phát triển mạnh. Từ 24 ÷ 72 giờ chủng lactic phát triển tăng nhanh về sinh khối và đạt cực đại 9,4 log(CFU/g), sau 72 giờ thì tốc độ phát triển bắt đầu suy yếu. Chủng LB2 là chủng không chỉ có khả năng khử cyanua tổng tốt nhất mà còn là chủng có tốc độ phát triển mạnh và ổn định trên môi trường bã sắn. Vì thế, chủng LB2 là chủng vi khuẩn lactic được lựa chọn để khử hàm lượng cyanua tổng trên môi trường bã sắn. 4. Sự chuyển hóa cyanua trong tế bào vi khuẩn lactic Chủng LB2 được lựa chọn để thực hiện thí nghiệm đánh giá sự chuyển hóa cyanua trong tế bào vi khuẩn lactic. Trước khi phá vỡ tế bào vi khuẩn lactic, hàm lượng HCN trong 100 ml MRS lỏng là 113,5 µg. Tiến hành phá vỡ tế bào vi khuẩn lactic có trong 100 ml MRS sau khi nuôi tăng sinh chủng LB2 ở 30 ± 2 oC trong 24 giờ thì hàm lượng HCN trong tế bào là 0 µg. Điều đó chứng tỏ rằng, cyanua trong môi trường tăng sinh đã được vi khuẩn lactic chuyển hóa thành CO2, NH3 và glucose trong suốt quá trình lên men và bên trong tế bào vi khuẩn lactic LB2 không còn cyanua. Vì vậy, việc sử dụng vi khuẩn lactic LB2 trong quá trình giải độc sản phẩm sắn là an toàn và hợp lí. Chủng vi khuẩn LB2 bắt màu gram dương trên tiêu bản nhuộm gram, catalase âm tính, trực khuẩn, không sinh bào tử. Hình 3. Chủng LB2 Hình 4. Tiêu bản nhuộm Gram chủng LB2 Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2014 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 71 Kế t quả tra cứ u giả i trì nh tự gen chỉ ra rằ ng chủ ng vi khuẩ n nà y có mứ c độ tương đồ ng vớ i L. plantarum đạ t 100%. Xác định chủng LB2 là L. plantarum. IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận Qua quá trình phân lập, tuyển chọn nghiên cứ u nà y đã chọn được chủng L. plantarum LB2 đáp ứng đủ yêu cầu cho việc lên men bã sắn: có khả năng phát triển mạnh trên trên môi trường bã sắn với mật độ tế bào đạt 9,4 log(CFU/g) ở 30 ± 20C trong 72 giờ lên men và hàm lượng cyanua tổng giảm từ 241,4 ± 5,22 xuống 73,52 ± 3,1 mg/kg khối lượng khô, hàm lượng cyanua tự do giảm từ 104 ± 3,22 mg/kg khối lượng khô xuống 32 ± 0,76 mg/kg khối lượng khô. 2. Kiến nghị Nghiên cứu ứng dụng chủng lactic LB2 vào quy trình ủ chua bã sắn nhằm khử hàm lượng cyanua tổng để sử dụng làm thức ăn chăn nuôi gia súc. Kết quả giải trình tự gen 16S của loài LB2 như sau: AGAGTTTGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGCCGGCGGTGTGCCTAATACATGCAAGTCGAAC- GCGTTGGCCCAATTGATTGATGGTGCTTGCACCTGATTGATTTTGGTCGCCAACGAGTGGCGGACGGGT- GAGTAACACGTAGGTAACCTGCCCAGAAGCGGGGGACAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAA- CAACGTTGTTCGCATGAACAACGCTTAAAAGGTGGCTTCTCGCTATCACTTCTGGATGGACCTGCGGTG- CATTAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCGATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGC- CACAATGGGACTGAGACACGGCCCATACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGGC- GCAAGCCTGATGGAGCAACACCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGTTA- AAGAAGAACACGTATGAGAGTAACTGTTCATACGTTGACGGTATTTAACCAGAAAGTCACGGCTAACTA CGTGC Kế t quả tra cứ u trên BLAST SEARCH như sau: TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. 10 TCN 604 : 2004. Nông sản thực phẩm - Phương pháp xác định hàm lượng axit xyanhydric. 2. Ngô Thị Phương Dung và cs, 2011. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả năng sinh chất kháng khuẩn. Tạp chí Khoa học. Đại học Cần Thơ, 19a: 176-184. 3. Nguyễn Thị Diễm Hương, Đỗ Thị Bích Thủy, 2012. Xác định và khảo sát một số tính chất có lợi của chủng Lactobacillus fermentum DC1 phân lập tử sản phẩm dưa cải Huế. Tạp chí Khoa học. Đại học Huế, 2 (71): 177-187. 4. Mai Đàm Linh và cs, 2008. Đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn lactic phân lập trên địa bàn thành phố Hà Nội. Tạp chí Khoa học. Đại học quốc gia Hà Nội. Khoa học Tự nhiên và Công nghệ. 24: 221-226. 5. Đào Thị Lương và cs, 2010. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic dùng trong chế biến và bảo quản thức ăn thô xanh và phụ phẩm n ông nghiệp cho gia súc nhai lại. Di truyền học và ứng dụng - Chuyên san Công nghệ sinh học, 6. 6. Nguyễn Thị Thương và cs, 2013. Tuyển chọn chủng vi khuẩn Lactic lên mên dịch ép óc đậu trong sản xuất đậu khuôn. Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản. Trường Đại học Nha Trang, : 170-175. 7. Hồ Diễm Thúy, Pham Thị Mai, Nguyễn Minh Trí, 2013. Xác định hàm lượng cyanua tổng trong sắn và bã sắn. Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản. Trường Đại học Nha Trang. 8. Nguyễn Hữu Văn và cs, 2008. Đánh giá giá trị dinh dưỡng của bã sắn công nghiệp ủ chua với các phụ gia để làm thức ăn cho gia súc nhai lại. Tạp chí Khoa họ-. Đại học Huế, 46. Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2014 72 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG 9. QCVN 01 - 78: 2011/BNNPTN . Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia. Thức ăn chăn nuôi - Các chỉ tiêu vệ sinh an toàn và mức giới hạn tối đa cho phép trong thức ăn chăn nuôi. 10. Quyết định số 08/2006/QĐ-BYT của Bộ Y tế ngày 06 tháng 02 năm 2006 về việc ban hành Tiêu chuẩn ngành y tế, trong đó có thường quy kỹ thuật xác định tổng số vi khuẩn Lactic trong thực phẩm. 11. TCVN 4326:2001. Thức ăn chăn nuôi. Xác định độ ẩm và hàm lượng chất bay hơi khác. Tiếng Anh 12. 12.Amoa-Awua, W.K.A., Appoh, F., Jakobsen, M., 1996. Lactic acid fermentation of cassava dough into agbelima", Int. J. Food Microbiol. 31: 87-98. 13. 13.Axelsson, Lars., 2004. Acid lactic Bacteria: Classifi cation and Physiology. Acid lactic Bacteria microbiological and Functional Aspects, Norwegian Food Research Institute, A°s, Norwa: 19-67. 14. 14.Bukola, C. A., and Abiodun, A. O., 2008. Screening of Lactic Acid Bacteria Strains Isolated from Some Nigerian Fermented Foods for EPS Production. World Applied Sciences Journal. 4 (5): 741-747. 15. 15.Ciba Foundation Symposium 140, 2008. Cyanide Compounds in Biology. 16. 16.Eric, M.O. and Kwaku, T.D., 2004. Souring and breakdown of cyanogenic glucosides during the processing of cassava into akyeke. International Journal of Food Microbiology, 93: 115-121. 17. 17.Farideh Tabatabaie and Mortazavi., 2010. Effects of Ultrasound Treatment on Viability and Autolysis of Starter Bacteria in Hard Cheese. American-Eurasian journal of agricultural & environmental sciences, 8 (3): 301-304. 18. 18.Giraud, E., Gosselin, L., 1992. Degradation of cassava linamarin by lactic acid bacteria. Biotechnology, 14: 593-598. 19. 19.Jensen and Ghaffar, HL., 1979. Cyanuric acid as nitrogen sources for microorganisms. Arch. Microbiol, 67: 1-5. 20. 20.Kobawila, S.C. and Louembe, D., 2005. Reduction of the cyanide content during fermentation of cassava roots and leaves to produce bikedi and ntoba mbodi, two food products from Congo. African Journal of Biotechnology, 4 (7): 689 - 696. 21. 21.Maduagwa, E.N., 1983. Differential effects on the cyanogenic glucoside content of fermenting cassava root pulp by beta glucosidase and microbial activity. Toxicol. Lett, 15: 335-339. 22. 22.Nartey, F., 1968. Studies on cassava, cyanogenesis: the biosynthesis of linamarin and lotaustralin in etiolated seedlings. Phytochemistry, 7: 1307- 1312. 23. 23.Ogbonnaya, N. and Florence Onyebuchi, A., 2011. Linamarase Enzyme from Lactobacillus delbrueckii NRRL B-763: Purifi cation and Some Properties of a β-Glucosidase. J. Mex. Chem. Soc, 55 (4): 246-250. 24. 24.Okafor, N. and Ejiofor, M.A.N., 1986. The microbial breakdown of linamarin in fermenting pulp of cassava (Manihot esculenta Crantz. J. Miren 2: 327-338. 25. 25.Okafor, N., and Ejiofor, M.A.N., 1985. The linamarase of Leuconostoc mesenteroides production, isolation and some properties. J. Sci. Food Agric, 36: 667-678. 26. 26.Tchango Tchango, and Bikoï, A., 1999. Cassva: Post - harvest Operations. Centre de Recherches Regionales sur Bananiers et Plantains Cameroon (CRBP): 1-126.