Tối ưu hóa thành phần môi trường lên men chủng bacillus subtillis thu nhận nattokinase tái tổ hợp bằng phương pháp đáp ứng bề mặt - Trần Quốc Tuấn

TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 130-137 130 TỐI ƯU HÓA THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG LÊN MEN CHỦNG Bacillus subtillis THU NHẬN NATTOKINASE TÁI TỔ HỢP BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐÁP ỨNG BỀ MẶT Trần Quốc Tuấn1*, Nguyễn Thị Thu Kiều1, Lê Thị Thúy Ái1, Đinh Minh Hiệp2, Trần Cát Đông3 1Trường Đại học Khoa học tự nhiên, ĐHQG tp. Hồ Chí Minh, *trqtuan@hcmus.edu.vn 2Sở Khoa học và Công nghệ tp. Hồ Chí Minh 3Trường Đại học Y-Dược tp. Hồ Chí Minh TÓM TẮT: Nattokinase là một serin protease có hoạt tính thủy phân fibrin, đã được chứng minh lâm sàng về hiệu quả và an toàn trong điều trị huyết khối ở người qua đường uống. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành tối ưu hóa thành phần môi trường nuôi cấy nhằm thu nhận nattokiase từ chủng Bacillus subtillis DB104 tái tổ hợp. Các nguồn nitơ và carbon thích hợp được chọn lọc làm cơ sở cho việc sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính nattokinase bằng thiết kế thí nghiệm Plackett-Burman. Trong các yếu tố khảo sát, pepton đậu nành, MgSO4 và NaCl là ba yếu tố tác động nhiều nhất (p<0,05). Thí nghiệm được thiết kế theo phương pháp đáp ứng bề mặt (Response surface methodology-RSM). Kết quả nhận được môi trường thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp nattokinase gồm: 10 g/l pepton đậu nành, 0,88 g/l MgSO4, 5 g/l NaCl. Thời gian lên men sau 16 giờ cho hoạt tính nattokinase cao nhất 152 FU/ml cao hơn trước khi tối ưu 1,8 lần (83 FU/ml) chiếm 45%. Từ khóa: Bacillus subtilis, hoạt tính tiêu fibrin, nattokinase tái tổ hợp, tiêu huyết khối. MỞ ĐẦU Sumi et al. (1987) [13] lần đầu tiên đã phát hiện nattokinase là một serine protease có trong sản phẩm Natto truyền thống của Nhật Bản, nattokinase được quan tâm nhiều nhờ khả năng làm tan đặc hiệu fibrin. Enzym này được nhận định khả năng phân hủy trực tiếp fibrin và rất có ích trong việc phân hủy huyết khối nội sinh ở người [3, 13]. Hơn nữa, nattokinase cũng tăng cường sản sinh plasmin, enzym nội sinh có chức năng tương cận [7]. So sánh với các dược phẩm thông thường khác, nattokinase có nhiều ưu điểm như tính an toàn, hiệu quả và đã được chứng minh lâm sàng, hoạt tính cao và tồn tại ở nội mạc trong thời gian dài bằng liều uống nên hiệu quả điều trị được duy trì. Từ trước đến nay, nattokinase được thu nhận chủ yếu bằng lên men bán rắn chủng Bacillus subtilis natto trên cơ chất đậu nành nấu chín hay lên men dịch thể. Thực tế nattokinase được thu nhận từ cơ chất hay môi trường lỏng thường có hàm lượng không cao và hoạt tính ít ổn định. Hiện nay đã có những nghiên cứu bước đầu tạo nattokinase tái tổ hợp có hoạt tính bằng hệ thống vi khuẩn (Escherichis coli, Bacillus subtilis, Lactococcus sp.). Hướng nghiên cứu nattokinase tái tổ hợp bước đầu cho thấy hiệu quả vì enzym tái tổ hợp được biểu hiện có hoạt tính và tiết ngoại bào [1, 6, 8]. Các nghiên cứu trong nước theo hướng nattokinase tái tổ hợp còn rất ít và chỉ có 1 nghiên cứu của Nguyễn Thị Thảo và Quyền Đình Thi (2013) [14] đã nhân dòng, phân tích trình tự và biểu hiện gen mã hóa nattokinase từ chủng B. subtilis VTCC-DVN-12-01 và biểu hiện trên B. subtilis WB800. Trong những hướng nhằm nâng cao hoạt tính nattokinase thu nhận là việc tối ưu hóa thành phần nuôi cấy đang được quan tâm nghiên cứu. Phương pháp tối ưu hóa truyền thống thực hiện việc tối ưu từng nhân tố (one- factor-at-a-time) tuy đơn giản, dễ thực hiện và những tác động của các thành phần có thể được nhận thấy trên đồ thị mà không cần phải phân tích thống kê. Tuy nhiên, mô hình này thường xuyên thất bại trong việc xác định vị trí tại khu vực đáp ứng tối ưu vì những tác động chung của các yếu tố trên bề mặt đáp ứng không thấy được, điều này có ý nghĩa khi lên men ở quy mô lớn [10]. Thiết kế thí nghiệm thống kê cung cấp một Tran Quoc Tuan et al. 131 cách tiếp cận hiệu quả để tối ưu hóa. phương pháp này tối ưu nhiều hơn một yếu tố ở hai hay nhiều mức độ khác nhau như thiết kế các yếu tố đầy đủ (full factorial design) hay thiết kế Box- Behnken (Box-Behnken design-BBD). Với việc sử dụng thống kê trong thiết kế thí nghiệm được thực hiện từ việc sàng lọc các nguồn nitơ, carbon, nguồn khoáng và tối ưu hóa các yếu tố được chọn nhằm tìm ra môi trường tối ưu cho thu nhận nattokinase đạt năng xuất cao nhất là hướng tiếp cận của các công trình nghiên cứu về nattokinase gần đây [2, 4, 9, 11]. Chúng tôi đã dòng hóa gen mã hóa nattokinase dưới promoter mạnh phụ thuộc IPTG là PSgrac và thiết lập được chủng Bacillus subtilis DB104 biểu hiện và tiết nattokinase ngoại bào có hoạt tính. Trong nghiên cứu này chúng tôi tập trung khảo sát tối ưu hóa môi trường nuôi cấy cho thu nhận hiệu quả nattokinase. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Chủng vi sinh vật Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis DB104 [his, nprR2, nprE18, aprA3] (Trường Đại học Bayreuth, Đức) mang casset biểu hiện gen mã hóa nattokinase aprN trên plasmid pBG01- aprN. Sự biểu hiện nattokinase được kiểm soát bởi promoter phụ thuộc chất cảm ứng IPTG, PSgrac. Xác định hoạt tính nattokinase Hoạt tính nattokinase được định lượng theo sự thủy phân fibrin [16]. Cụ thể, hút 0,4 ml dung dịch 0,72% fibrinogen và 1,4 ml đệm borate (pH 8,5) vào ống nghiệm. Thêm 0,1 ml dung dịch thrombin 20 U/ml. Sau đó thêm 0,1 ml dịch enzym thu nhận, ủ ở 37oC. Sau 1 giờ, bổ sung 2 ml trichloroacetic acid 0,2 M. Ly tâm 15.000 vòng trong 10 phút, thu nhận dịch trong. Đo độ hấp thụ của dịch trong ở bước sóng 275 nm. Một đơn vị hoạt độ nattokinase (FU- fibrinolytic unit) được định nghĩa là sự gia tăng 0,01 độ hấp thụ trong một phút của dung dịch phản ứng. Điện di polyacrylamide và phân tích hoạt tính trên gel (zymography) Điện di protein SDS-PAGE được thực hiện trên gel 12,5% polyacrylamide và 4% gel gom theo phương pháp được mô tả bởi Leammli (1970) [5]. Phân tích zymography nhằm xác định “băng” hoạt tính ngay trên gel, thực hiện thí nghiệm tương tự điện di SDS-PAGE, khi tiến hành đổ gel polyacrylamide thêm fibrin 0,3% (không xử lý mẫu với nhiệt). Sau thời gian chạy điện di, loại SDS bằng Triton X-100. Tiến hành phản ứng trên gel trong dung dịch đệm Tris-HCl pH 7,8. Kết thúc phản ứng nhuộm gel với Coomassie Brilliant Blue G-250. Giải nhuộm và phát hiện băng hoạt tính (không màu). Tối ưu hóa và thiết kế thí nghiệm Chọn lọc nguồn nitơ và nguồn carbon Khảo sát bảy nguồn nitơ và năm nguồn carbon trong thành phần môi trường lên men thu nhận nattokinase có chứa 1 g/l MgSO4, 0,2 g/l CaCl2 và 2 g/l K2HPO4. Khảo sát nguồn nitrogen sử dụng nguồn carbon là glucose 10 g/l, thay đổi các nguồn nitơ với nồng độ 10 g/l của cao nấm men, pepton, pepton đậu nành, trypton, glutamate, (NH4)2SO4 và NaNO3. Khi nghiên cứu nguồn carbon, sử dụng nguồn nitrogen là pepton 10 g/l, thay đổi các nguồn carbon với nồng độ 10 g/l của glucose, fructose, maltose, sucrose và xylose. Mỗi công thức được lặp lại ba lần. Sàng lọc yếu tố có ý nghĩa bằng thiết kế Plackett-Burman Sử dụng thiết kế Plackett-Burman là một cách hiệu quả để sàng lọc các thông số chính trong một số lượng lớn các yếu tố của quá trình tối ưu [10]. Nguồn carbon và nguồn nitơ đã được sàng lọc trong thí nghiệm trước được thêm vào môi trường nuôi cấy được tối ưu hóa. Thiết kế Plackett-Burman cho phép đánh giá các yếu tố có mức ảnh hưởng đến sinh tổng hợp nattokinase, mỗi yếu tố đã được kiểm tra ở hai cấp độ: mức thấp (-1) và mức cao (+1). Các yếu tố được chọn cho nghiên cứu này là glucose, pepton đậu nành, K2HPO4, MgSO4, NaCl và CaCl2 được liệt kê trong bảng 1. Thiết kế ma trận Plackett-Burman trình bày trong bảng 2. Kết quả nghiên cứu được phân tích bằng chương trình “Design Expert® 7.0" Stat- Ease, Inc., Minneapolis, USA. TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 130-137 132 Bảng 1. Các biến trong ma trận Plackett-Burman Mức Mức độ ảnh hưởng Yếu tố Đơn vị Ký hiệu Thấp (-1) Cao (+1) Ảnh hưởng Prob>F Glucose g/L X1 1,25 10 2,03b 0,2710 Pepton đậu nành g/L X2 5 15 12,13a 0,0007 K2HPO4 g/L X3 1,25 3 -2,08b 0,2607 MgSO4 g/L X4 0,25 1,5 9,36a 0,0023 NaCl g/L X5 2,5 7,5 4,58a 0,0382 CaCl2 g/L X6 0,05 0,4 -2,59b 0,1742 aCó ý nghĩa ở độ tin cậy  = 0,05; bKhông có ý nghĩa ở độ tin cậy  = 0,05. Bảng 2. Ma trận thiết kế thí nghiệm Plackett-Burman Các biến Hoạt tính nattokinase (FU/ml) Thí nghiệm X1 X2 X3 X4 X5 X6 Thực nghiệm Mô hình 1 1 1 -1 1 1 1 135,6 134,0 2 -1 1 1 -1 1 1 107 107,1 3 1 -1 1 1 -1 1 93,7 96,5 4 -1 1 -1 1 1 -1 135 135,2 5 -1 -1 1 -1 1 1 83 82,9 6 -1 -1 -1 1 -1 1 103 96,6 7 1 -1 -1 -1 1 -1 96 96,3 8 1 1 -1 -1 -1 1 101 106,2 9 1 1 1 -1 -1 -1 115 107,2 10 -1 1 1 1 -1 -1 118 121,9 11 1 -1 1 1 1 -1 109,7 110,8 12 -1 -1 -1 -1 -1 -1 80,7 83,1 Bảng 3. Nồng độ các yếu tố sử dụng trong Box-Behnken Mức Yếu tố Đơn vị Ký hiệu -1 0 +1 Peptone đậu nành g/L X1 5 10 15 MgSO4 g/L X2 0,25 0,625 1,5 NaCl g/L X3 2,5 5,0 7,5 Tối ưu hóa bằng phương pháp đáp ứng bề mặt Phương pháp bề mặt [10] đáp ứng là một kỹ thuật mô hình thực nghiệm được sử dụng để đánh giá mối quan hệ giữa một tập hợp của các yếu tố thử nghiệm kiểm soát. Dựa trên kết quả kiểm tra biến, mô hình kiểm tra các biến thử nghiệm cần thiết cho tổng hợp nattokinase tối ưu bằng cách sử dụng thiết kế Box-Behnken và phương pháp bề mặt đáp ứng. Trong nghiên cứu này, xác định giá trị tối ưu của ba yếu tố chính từ kết quả sàng lọc thu được và được nghiên cứu ở 3 mức (-1, 0 và +1) (bảng 3) với 17 thí nghiệm trong đó có 5 thí nghiệm ở tâm (bảng 4). Hàm đáp ứng được chọn là hoạt tính nattokinase (Y, FU/ml dịch nuôi cấy), mô hình hóa được biểu diễn bằng phương trình bậc hai: Y = B0 + B1X1 + B2X2 + B3X3 + B12X1X2 + B13X1X3 + B23X2X3 + B11X12 + B22X22 + B33X32. Trong đó, B1, B2, B3 là các hệ số bậc 1; B11, B22 và B33 là hệ số bậc 2; B12, B23 và B13 là các hệ số tương tác của từng cặp yếu tố; X1, X2, X3, X11, X22, X33, X12, X23 và X13 là các biến độc lập. Số liệu được phân tích bằng chương trình Tran Quoc Tuan et al. 133 “Design Expert® 7.0" Stat-Ease, Inc., Minneapolis, Hoa Kỳ. Từ kết quả phân tích xác định mức tối ưu của các yếu tố khảo sát cho hoạt tính nattokinase cao nhất. Bảng 4. Thiết kế Box-Behnken Các biến Hoạt tính nattokinase (FU/ml) Thí nghiệm X1 X2 X3 Thực nghiệm Mô hình 1 -1 -1 0 95 94,75 2 1 -1 0 115 113,75 3 -1 1 0 102 103,25 4 1 1 0 141 141,25 5 -1 0 -1 97 99 6 1 0 -1 129 132 7 -1 0 1 112 109 8 1 0 1 135 133 9 0 -1 -1 102 100,25 10 0 1 -1 117 113,75 11 0 -1 1 98 101,25 12 0 1 1 122 123,75 13 0 0 0 145 146,8 14 0 0 0 148 146,8 15 0 0 0 145 146,8 16 0 0 0 149 146,8 17 0 0 0 147 146,8 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên hoạt tính nattokinase Hình 1. Ảnh hưởng của nguồn nitrogen lên hoạt tính nattokinase Trong các nguồn nitơ được khảo sát (hình 1) nhận thấy, pepton đậu nành có ảnh hưởng lớn nhất đến hoạt tính nattokinase, đạt giá trị 92±1,5 FU/ml. Các nguồn nitrogen hữu cơ khác như cao nấm men, tryptone và pepton cho giá trị hoạt tính thấp hơn, khoảng từ 10-40% so với nguồn pepton đậu nành. Trong khi đó, các nguồn nitrogen vô cơ như (NH4)2SO4 và NaNO3 không thích hợp cho lên men thu nhận nattokinase. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu của Liu et al. (2005) [9], Prafulla et al. (2010) [11] và Rym et al. (2009) [12]. Qua kết quả này pepton đậu nành được chọn làm nguồn nitơ thích hợp cho lên men thu nhận nattokinase. H oạ t t ín h na tto ki na se (F U /m l) Nguồn nitrogen TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 130-137 134 Ảnh hưởng của nguồn carbon lên hoạt tính nattokinase Nguồn maltose cho kết quả hoạt tinh nattokinase cao nhất, đạt 85,5±0,95 FU/ml trong các nguồn carbon khảo sát, sau đó là nguồn glucose và sucrose. Trong khi đó, khi sử dụng nguồn fructose và xylose cho hoạt tính nattokinase thấp, điều này chứng tỏ 2 nguồn này không thích hợp cho sự phát triền của Bacillus subtilis từ đó làm giảm hoạt tính nattokinase thu nhận (hình 2). Xét về giá trị kinh tế, chọn nguồn glucose là nguồn carbon thích hợp cho lên men thu nhận nattokinase. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Jau et al. (2009) [4], Liu et al. (2005) [9], Rym et al. (2010) [12]. Sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính nattokinase Với sáu yếu tố được chọn để sàng lọc gồm glucose, peptone đậu nành, K2HPO4, MgSO4, NaCl và CaCl2 với hai mức thấp và cao, tiến hành thí nghiệm theo ma trận Plackett-Burman. Qua kết quả xử lý bằng phần mềm Design expert 7.0 (bảng 1) cho thấy, các yếu tố có giá trị ảnh hưởng dương và lớn gồm pepton đậu nành, MgSO4 và NaCl sẽ ảnh hưởng tới hoạt tính nattokinase với mức ý nghĩa =0,05 (p- value<0,05). Trong khi đó, kết quả nghiên cứu sàng lọc yếu tố của Liu et al. (2005) [9] chọn pepton đậu nành, CaCl2 và cao nấm men, với Chen et al. (2007) [2] chọn peptone đậu nành, K2HPO4 và CaCl2. Jau et al. (2009) [4] nhận thấy MgSO4, K2HPO4 và glucose ảnh hưởng mạnh lên hoạt tính nattokinase. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi chọn pepton đậu nành, MgSO4 và NaCl cho thiết kế thí nghiệm theo phương pháp đáp ứng bề mặt-Box-Behnken. Hình 2. Ảnh hưởng của nguồn carbon lên hoạt tính nattokinase Bảng 5. Kết quả phân tích ANOVA Source Tổng bình phương Bậc tự do Sai số chuẩn Ảnh hưởng F - Value Prob > F Model 6464,94 9 1,41 72,56 < 0,0001 X1 1624,50 1 1,11 14,25 164,09 < 0,0001 X2 648,00 1 1,11 9 65,45 < 0,0001 X3 60,50 1 1,11 2,75 6,11 0,0427 X1X2 90,25 1 1,57 4,75 9,12 0,0194 X1X3 20,25 1 1,57 -2,25 2,05 0,1957 X2X3 20,25 1 1,57 2,25 2,05 0,1957 X12 660,53 1 1,53 -12,525 66,72 < 0,0001 X22 1861,27 1 1,53 -21,025 188,01 < 0,0001 X32 1081,27 1 1,53 -16,025 109,22 < 0,0001 Sai số 12,80 4 Tổng 6534,24 16 R2 = 0,9894; CV = 2,55%; R2-điều chỉnh = 0,9758; R2-dự đoán = 0,8586. H oạ t t ín h na tto ki na se (F U /m l) Nguồn carbon Tran Quoc Tuan et al. 135 Tối ưu hóa giá trị các yếu tố ảnh hưởng lên hoạt tính nattokinase Các thí nghiệm lên men thu nhận nattokinase được thực hiện trên ba yếu tố ở ba mức gồm 17 công thức trong đó 5 lần lặp lại của các điểm trung tâm được thể hiện trong bảng 4 với các giá trị hàm đáp ứng. Kết quả phân tích ANOVA (bảng 5) cho thấy, mô hình có ý nghĩa thống kê (P0,75 chứng tỏ mô hình tương thích với thực nghiệm. Hơn nữa, giá trị R2 dự đoán là 0,8586 phù hợp với R2 điều chỉnh là 0,9758 (độ lệch 0,1172< 0,2), tỷ lệ tín hiệu so với nhiễu là 21,57>4 thể hiện tín hiệu đã đầy đủ. Hình 3. Mặt đáp ứng hoạt tính nattokinase theo hai yếu tố: A. Pepton đậu nành (X1) - MgSO4 (X2) với NaCl ở nồng độ 5 g/l; B. Pepton đậu nành (X1) - NaCl (X3) với MgSO4 ở nồng độ 0,88 g/l; C. MgSO4 (X2) - NaCl (X3) với pepton đậu nành ở nồng độ 10 g/l. Phương trình hồi quy nhận được như sau: Hoạt tính nattokinase (FU/ml) = 146,8 + 14,25X1 + 9X2 + 2,75X3 + 4,75X1X2 – 2,25X1X3 + 2,25X2X3 – 12,55X12 – 21,02X22 – 16,03X32. Để xác định mức độ tối ưu của mỗi biến cho hoạt tính nattokinase tối ưu, đồ thị bề mặt ba chiều tương tác được xây dựng với trục Z là hoạt tính nattokinase và hai biến độc lập bất kỳ, trong khi duy trì biến còn ở mức tối ưu của chúng. Kết quả ở hình 3A cho thấy, hoạt tính nattokinase tăng cực đại khi gia tăng pepton đậu nành và MgSO4. Trong khi đó, ở hình 3B và 3C cho thấy hoạt tính nattokinase ảnh hưởng nhiều bởi pepton đậu nành và MgSO4. NaCl dường như không ảnh hưởng đến hoạt tính nattokinase. Từ các dữ liệu thí nghiệm thu được và phương trình trên, các thông số tối ưu của mỗi biến được xác định: pepton đậu nành 10 g/l, MgSO4 0,88 g/l và NaCl 5 g/l, mô hình dự đoán hoạt tính nattokinase tối đa đạt được (146,8 FU/ml). Mô hình được kiểm chứng khi thực hiện thí nghiệm tại các giá trị tối ưu trên đạt hoạt tính nattokinase là 152±12 FU/ml sau 16 giờ nuôi cấy. Kết quả thể hiện rõ trong hình 4 với enzyme nattokinase có kích thước 27,7 kDa. Khi so sánh với môi trường khi chưa tối ưu (pepton 10 g/l, glucose 5 g/l, MgSO4 1 g/l, CaCl2 0,2 g/l và K2HPO4 2 g/l) hoạt tính nattokinase đạt 83 FU/ml sau tối ưu hóa tăng 1,8 lần (45%). Theo Chen et al. (2007) [2], sau khi tối ưu hóa thành phần môi trường nuôi cấy Bacillus subtilis WB700 thu nhận nattokinase tái tổ hợp tăng 1,5 lần so với môi trường trước tối ưu. Hình 4. Điện di SDS-PAGE và phân tích zymography Giếng 1: Thang protein chuẩn; giếng 2: B. subtilis DB104 không mang gen aprN; giếng 3: Dịch nuôi cấy chủng B. subtillis DB104 mang gen aprN; giếng 4: Phân tích zymography. B C A TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 130-137 136 KẾT LUẬN Từ sáu yếu tố ban đầu chọn ba yếu tố ảnh hưởng là pepton đậu nành, MgSO4 và NaCl bằng thiết kế ma trận Plackett-Burman. Sử dụng phương pháp đáp ứng bề mặt-Box-Behnken đã tối ưu hóa thành phần môi trường cho hoạt tính nattokinase cao nhất với 10 g/l pepton đậu nành, 0,88 g/l MgSO4 và 5 g/l NaCl. Hoạt tính tối đa đạt được là 152 FU/ml sau 16 giờ nuôi cấy chủng B. subtilis DB104 tái tổ hợp. Kết quả làm tiền đề cho nghiên cứu thu nhận nattokinase với quy mô pilot trên 10 lít để có thể ứng dụng làm nguyên liệu trong sản xuất thực phẩm chức năng. Lời cảm ơn: Công trình được hỗ trợ về kinh phí từ đề tài “Nghiên cứu tạo dòng và nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis sản xuất enzym nattokinase tái tổ hợp có hoạt tính cao”, thuộc đề tài trọng điểm Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh năm 2011. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Chen P. T., Chiang C. J., Chao Y. P., 2007. Strategy to approach stable production of recombinant nattokinase in Bacillus subtilis. Biotechnol. Prog., 23(4): 808-813. 2. Chen P. T., Chiang C. J., Chao Y. P., 2007., 2007. Medium optimization for the production of recombinant nattokinase by Bacillus subtilis using response surface methodology. Biotechnol. Prog., 23(6): 1327-1332 3. Jovin I. S., Muller-Berghaus G., 2004. Interrelationship s between the fibrinolytic system and lipoproteins in the pathogenesis of coronary atherosclerosis. Atherosclerosis, 174: 225-233. 4. Jau K. W., Hua H. C., Ching S. H., 2009. Optimization of the medium components by statistical experimental methods to enhance nattokinase activity. Fooyin J. Health Sci., 1(1): 21-27. 5. Laemmli U. K, 1970. Cleavage of Structural Proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227: 680-685. 6. Lee J., Park S., Choi Won A., Lee Kyung- Hee, Jeong Y. K., Kong In-Soo, Park S., 1999. Production of a fibrinolytic enzyme in bioreactor culture by Bacillus subtilis BK- 17. J. Microbiol. Biotechnol., 9(4): 443-449. 7. Liang X., Zhang L., Zhong J., Huan L., 2007. Secretory expression of a heterologous nattokinase in Lactococcus lactis. Appl. Microbiol. Biotechnol., 75(1): 95-101. 8. Liang X., Jia S., Sun Y., Chen M., Chen X., Zhong J., Huan L., 2007. Secretory expression of nattokinase from Bacillus subtilis YF38 in Escherichia coli. Mol. Biotech., 37(3): 187-194. 9. Liu J., Xing J., Chang T., Ma Z., Liu H., 2005. Optimization of nutritional condition for nattokinase production by Bacillus natto NLSSE using statistical experimental methods. Process. Biochem., 40: 2757-2762. 10. Plackett R. L., Burman J. P., 1946. The design of optimum multifactorial experiments. Biometrika, 33: 305-325. 11. Prafulla M. M., Sagar V. G., Smita S. L., 2010. Production of nattokinase using Bacillus natto NRRL 3666: Media optimization, scale up, and kinetic modeling. Food Sci. Biotechnol., 19(6): 1593-1603. 12. Rym A., Anissa H., Mohamed H., Fakher F., Laila M., Kemel J., Moncef N., 2009. Fibrinolytic enzymes from a newly isolated marine bacterium Bacillus subtilis A26: characterization and statistical media optimization. Can. J. Microbiol., 55: 1049- 1061. 13. Sumi H., Hamada H., Koichiro N., Hajime H., 1990. Enhancement of the fibrinolytic activity in plasma by oral administration of nattokinase. Acta Haematol, 84: 139-143. 14. Thao Thi Nguyen, Thi Dinh Quyen, Hoang Thanh Le, 2013. Cloning and enhancing production of a detergent and organic solvent resistant nattokinase from Bacillus subtilis VTCC-DVN-12-01 by using an eight protease gene deficient Bacillus subtilis WB800. Microbial Cell Factories, 12: 79. Tran Quoc Tuan et al. 137 15. Unrean P., Nguyen H. A. N., Wonnop V., Panit K., 2012. Improvement of nattokinase production by Bacillus subtilis using an optimal feed strategy in fed-batch fermentation, KKU Res. J., 17(5). 16. Wang J. K., Chiu H. H., Hsieh C. S., 2009. Optimization of the medium components by statistical experimental methods to enhance nattokinase activity. Fooyin. J. Health Sci., 1(1): 21-27. OPTIMIZATION OF MEDIUM COMPOSITION FOR RECOMBINANT NATTOKINASE PRODUCTION FROM Bacillus subtillis BY USING RESPONSE SURFACE METHODOLOGY Tran Quoc Tuan1, Nguyen Thi Thu Kieu1, Le Thi Thuy Ai1, Dinh Minh Hiep2, Tran Cat Dong3 1 University of Sciences, National University of Ho Chi Minh city 2Department of Science and Technology Ho Chi Minh city 3 Faculty of Pharmacy - Medical University of Ho Chi Minh city SUMMARY Nattokinase is a serine protease with fibrinolytic activity whose clinical efficacy and safety for human by the oral route has been proven. In this study, we optimized the medium components for production of recombinant nattokinase from Bacillus subtillis DB104. Carbon and nitrogen sources from the different materials were selected in order to make the base for screening factors affecting nattokinase activity by Plackett-Burman experiments. Among factors surveyed, soya pepton, MgSO4 and NaCl were considered significant (p<0.05). These factors were subsequently optimized by using the response surface methodology (RSM). The obtained results showed the appropriate mediumfor the biosynthesis of nattokinase included 10 g/l soypepton, 0.88 g/l MgSO4, 5 g/l NaCl. After 16 hrs of fermentation, nattokinase activity reached the highest level of 152 FU/ml, 1.8 times higher than that in the pre-optimized one (83 FU/ml). Keywords: Bacillus subtilis, fibrinolytic activity, nattokinase activity, recombinant nattokinase, response surface methodology. Ngày nhận bài: 15-7-2013