Sự thay đổi số lượng vi khuẩn lactic trong quá trình lên men tự nhiên hạt ca cao và tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic thích hợp cho quá trình lên men ca cao

Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2013 118 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KEÁT QUAÛ NGHIEÂN CÖÙU ÑAØO TAÏO SAU ÑAÏI HOÏC SỰ THAY ĐỔI SỐ LƯỢNG VI KHUẨN LACTIC TRONG QUÁ TRÌNH LÊN MEN TỰ NHIÊN HẠT CA CAO VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN LACTIC THÍCH HỢP CHO QUÁ TRÌNH LÊN MEN CA CAO CHANGES IN THE NUMBER OF LACTIC BACTERIA IN NATURAL FERMENTATION OF COCOA AND SELECTION OF LACTIC BACTERIAL STRAIN SUITABLE FOR COCOA FERMENTATION Võ Thị Mỹ Lộc1, Mai Thị Tuyết Nga2, Nguyễn Minh Trí Ngày nhận bài: 13/11/2012; Ngày phản biện thông qua: 11/3/2013; Ngày duyệt đăng: 15/5/2013 TÓM TẮT Nghiên cứu theo dõi sự thay đổi số lượng vi khuẩn lactic trong quá trình lên men tự nhiên các hạt ca cao và chất lượng ca cao thành phẩm của 12 mẫu ca cao lên men. Kết quả cho thấy mẫu có chất lượng tốt nhất sau lên men (xác định bằng phương pháp cắt hạt) cũng là mẫu có số lượng vi khuẩn lactic cao nhất. Điều này cho thấy vai trò của vi khuẩn lactic trong lên men tác động đến chất lượng sản phẩm ca cao sau lên men. Ở mẫu đạt chất lượng cao nhất, vi khuẩn lactic có mặt sau 48 h lên men và tồn tại trong suốt quá trình này, nhóm vi khuẩn lactic chiếm chủ yếu thuộc loài Lactobacillus fermentum. Từ khóa: vi khuẩn lactic, ca cao, lên men tự nhiên ABSTRACT Changes in the number of lactic bacteria during natural box fermentation of cocoa were studied. The results showed that among the 12 observed samples, the one with the best quality, determined by cut test, had the highest number of lactic bacteria. This indicated the role of lactic bacteria during cocoa fermentation to the fermented product quality. In the best sample, lactic acid bacteria presented after 48 h of fermentation and the predominating strain was Lactobacillus fermentum. Key words: lactic bacteria, cocoa, natural fermentation 1 Võ Thị Mỹ Lộc: Lớp Cao học Công nghệ Sau thu hoạch 2010 - Trường Đại học Nha Trang 2 TS. Mai Thị Tuyết Nga, 3 TS. Nguyễn Minh Trí: Khoa Công nghệ thực phẩm - Trường Đại học Nha Trang I. ĐẶT VẤN ĐỀ Lên men ca cao là công đoạn đầu tiên trong chế biến chocolate. Ở giai đoạn này, màu sắc, hương vị và những hợp chất tiền sinh hương phát triển [8]. Quá trình lên men hạt ca cao tự nhiên chịu tác động rất lớn của vi sinh vật nói chung trong đó có vi khuẩn lactic. Vi khuẩn lactic chuyển hóa glucose, fructose và citrate thành acid lactic, thúc đẩy những biến đổi sinh hóa góp phần tăng hương vị chocolate [8]. Số lượng vi khuẩn lactic cao, cùng với sự có mặt của các nhóm vi sinh khác sẽ góp phần nâng cao chất lượng ca cao sau lên men. Do đó việc nghiên cứu sự thay đổi số lượng vi khuẩn lactic trong quá trình lên men hạt ca cao tự nhiên và tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic cho quá trình lên men hạt ca cao là việc làm cần thiết. Kết quả của nghiên cứu này sẽ làm tiền đề cho các nghiên cứu sau về vai trò của vi khuẩn lactic đến chất lượng hạt ca cao sau lên men, đồng thời nó cũng là bước khởi đầu phục vụ cho quá trình nghiên cứu chuyên sâu về lĩnh vực này từ đó góp phần ổn định và nâng cao chất lượng ca cao sau lên men. Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2013 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 119 Ca cao lên men được lấy mẫu phân tích vi sinh sau mỗi ngày lên men (24 h) cho đến khi kết thúc quá trình lên men. Tiến hành giữ chủng vi khuẩn lactic từ các mẻ lên men ca cao có chất lượng tốt. 2.2. Lên men ca cao Đập quả, tách hạt, lên men tự nhiên trong thùng xốp, mỗi mẻ 3,5kg hạt tươi, thời gian lên men 6 ngày, đảo trộn được thực hiện 2 lần trong quá trình lên men sau 48 h và 96 h lên men. 2.3. Đánh giá chất lượng hạt ca cao Kiểm tra chất lượng hạt sau lên men theo phương pháp cắt hạt. Việ c kiể m tra chấ t lượ ng hạ t liên quan đến quá trình lên men có thể đượ c thự c hiệ n bằ ng cá ch kiểm tra phân loại như sau: màu nâu hoà n toà n (lên men hoà n toà n), màu nâu mộ t phầ n, màu tím mộ t phầ n (lên men mộ t phầ n), tím (dưới mứ c lên men), chai xám (không lên men), bị hư hỏng, bị mốc, hoặc nảy mầm [5]. 2.4. Tiến hành đếm và phân lập vi khuẩn lactic từ ca cao lên men Chọn ngẫu nhiên 25 g hạt ca cao đang ủ lên men, pha loãng trong 225 ml dung dịch muối sinh lý vô trùng, cấy bề mặt trên đĩa thạch MRS [3], nuôi cấy ở nhiệt độ thường từ 3 - 5 ngày. Chọn ngẫu nhiên 10 khuẩn lạc trên môi trường MRS, định danh sơ bộ xác định tỷ lệ vi khuẩn lactic B%. Mật độ M của vi khuẩn lactic (CFU / g) được tính theo công thức sau [1]. M (CFU / g) = (Ai x Di / V) x B Trong đó: Ai : là số khuẩn lạc trung bình / đĩa ở độ pha loãng Di Di : là độ pha loãng cấy kiểm tra V : là thể tích mẫu cấy vào mỗi đĩa (ml). 2.5. Định danh sơ bộ vi khuẩn lactic: Vi khuẩn phát triển trên môi trường MRS đặc trưng hình thành khuẩn lạc, Gram dương, catalase âm tính. 2.6. Định danh chủng vi khuẩn bằng phương pháp giải trình tự gen Sử dụng phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA và tra cứu trên BLAST SEARCH. 2.7 Xử lý số liệu và vẽ đồ thị Xử lý số liệu và vẽ đồ thị bằng phần mềm Microsoft Excel 2007. Kết quả giữa các mẫu được so sánh bằng phân tích ANOVA, phép kiểm định Ducan. Các giá trị trung bình mang chữ cái khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 1. Chất lượng hạt ca cao sau lên men Kết quả kiểm tra chất lượng của 12 mẫu lên men đánh giá bằng phương pháp cắt hạt. Chất lượng ca cao liên quan đến tỷ lệ các hạt lên men hoàn toàn, tỷ lệ các hạt lên men một phần, tỷ lệ các hạt dưới lên men. II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Vật liệu nghiên cứu Quả ca cao được lên men là giống TD2 - quả có màu vàng sậm hoặc đỏ được thu mua ở tỉ nh Đăk-Lăk. Quả được lên men sau khi thu hoạch không quá 7 ngày. 2. Phương pháp nghiên cứu 2.1. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát: Hạ t ca cao Lên men Lấ y mẫ u định kỳ mỗi 24 giờ Đế m và phân lậ p vi khuẩ n lactic Giữ chủ ng Là m khô tự nhiên Đá nh giá chấ t lượ ng Hình 1. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2013 120 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG 1.1. Tỷ lệ hạt lên men hoàn toàn: Kết quả về tỷ lệ các hạt ca cao lên men hoàn toàn được trình bày trong hình 2. Hình 2. Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ hạt lên men hoàn toàn của 12 mẫu ca cao lên men Sau lên men chất lượng hạt ca cao cao hay thấp phụ thuộc vào tỷ lệ hạt lên men hoàn toàn / tổng số hạt kiểm tra (100 g), tỷ lệ này càng cao đồng nghĩa với chất lượng hạt ca cao sau lên men càng cao, do vậy có thể nói tỷ lệ này quyết định đến việc xếp loại chất lượng hạt ca cao sau lên men. Tỷ lệ hạt lên men hoàn toàn giữa các mẫu lên men khác nhau có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). Ở các mẫu nghiên cứu từ mẫu 1 đến mẫu 7, chất lượng hạt ca cao còn thấp, Từ mẫu 8 đến mẫu 12, chất lượng ca cao sau lên men cao hơn, cao nhất là ở mẫu 12, có tỷ lệ các hạt lên men hoàn toàn chiếm 93,33%, trong khi ở mẫu 4 chỉ đạt 55%. 1.2. Tỷ lệ hạt lên men một phần, dưới mức lên men: Bên cạnh tỷ lệ % hạt lên men hoàn toàn / tổng số hạt kiểm tra (100 g), còn có một số chỉ tiêu khác như: tỷ lệ hạt ca cao lên men một phần, tỷ lệ hạt ca cao dưới mức lên men và tỷ lệ các hạt không lên men. Kết quả các tỷ lệ này được trình bày ở hình 3, hình 4 (theo thứ tự). Hình 3. Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ hạt lên men một phần của 12 mẫu lên men Tỷ lệ hạt lên men một phần giữa 12 mẫu lên men khác nhau đáng kể (p<0,05). Qua biểu đồ cho thấy trong 12 mẫu lên men, mẫu 7 có tỷ lệ % hạt ca cao lên men một phần cao nhất với 14,43%, sau đó đến mẫu 4 là 13,73%, mẫu có tỷ lệ thấp nhất là mẫu 1 với 4,46%. Hình 4. Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ hạt dưới mức lên men (A) và tỷ lệ hạt không lên men (B) của 12 mẫu ca cao lên men Tỷ lệ các hạt dưới mức lên men cũng khác nhau rõ trong 12 mẫu nghiên cứu (p < 0,05). Kết quả cho thấy, mẫu 3 có tỷ lệ hạt dưới mức lên men cao nhất, chiếm 12,4%. Ở mẫu 12, không có hạt dưới mức lên men, và đây cũng là mẫu có chất lượng cao nhất trong 12 mẫu lên men. Tỷ lệ này càng cao cho thấy chất lượng hạt ca cao cuối cùng càng thấp. Tỷ lệ số hạt không lên men cao nhất ở mẫu 1, tỷ lệ 22,32%; sau đó đến mẫu 4 với 21,57%. Thấp nhất ở mẫu 12 (0%). Mẫu có tỷ lệ các hạt lên men cao nhất là mẫu 12. Hình ảnh các hạt ca cao lên men mẫu 12 được trình bày ở hình 5. Hạt ca cao sau lên men Kết quả cắt hạt ca cao sau lên men Hình 5. Hạt ca cao sau lên men và kết quả cắt hạt sau lên men của mẫu 12 Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2013 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 121 2. Sự thay đổi số lượng vi khuẩn lactic trong quá trình lên men ca cao tự nhiên Kết quả nghiên cứu trình bày ở trên cho thấy chất lượng của các mẫu ca cao cao khi tỷ hạt lên men tăng. Trong suốt quá trình lên men, tỷ lệ hạt lên men hoàn toàn cao luôn được mong đợi. Do đó, việc nghiên cứu để nâng cao tỷ lệ này là một việc vô cùng cần thiết, nó giúp nâng cao được chất lượng hạt ca cao thành phẩm. Trong quá trình lên men, vi khuẩn lactic có vai trò quan trọng trong việc tạo chất lượng tốt cho hạt ca cao lên men [6], Kết quả nghiên cứu về sự thay đổi số lượng vi khuẩn lactic trong quá trình lên men ca cao tự nhiên được trình bày trong hình 6. Hình 6. Sự biến đổi của vi khuẩn lactic của 12 mẫu trong suốt quá trình lên men Trong 12 mẫu nghiên cứu, số lượng vi khuẩn lactic ở mẫu 12 có số lượng lớn nhất. Chúng xuất hiện sau 24 h lên men với số lượng 2,78 lg (CFU / g), tăng dần sau 48 h, 72 h và 96 h lên men, đạt cao nhất sau 120 h lên men với số lượng 7,67 lg (CFU / g), khi kết thúc quá trình lên men số lượng giảm còn 7,37 lg (CFU / g). Trong 12 mẫu nghiên cứu, mẫu 12 có chất lượng hạt sau lên men cao nhất với số lượng vi khuẩn lactic lớn nhất. Do đó tuyển lựa chủng vi khuẩn lactic chủ yếu trong mẫu lên men này với hy vọng vi khuẩn lactic ở mẫu này có tác động tốt đến chất lượng hạt ca cao sau lên men. Trong nghiên cứu của Carr và cộng sự (1979), vi khuẩ n lactic xuất hiện với số lượng nhiều trong suốt quá trì nh lên men. Trong cá c nghiên cứ u về hệ vi sinh vậ t lên men ca cao ở Indonesia và Brazil cho thấ y vi khuẩn lactic là các vi sinh vật chiếm ưu thế sau khi lên men từ 36-48 h (Schwan và cộng sự, 1995; Ardhana & Fleet, 2003) [4]. Kết quả nghiên cứu của mẫu 12, vi khuẩn lactic xuất hiện sau 24 h lên men với số lượng 2,78 lg (CFU / g). Đố i vớ i lên men ở Brazil, trong suố t 48 giờ đầ u củ a quá trì nh lên men, số lượ ng vi khuẩ n lactic phổ biế n [8], nhưng trong nghiên cứu này chúng xuất hiện sau 48 h lên men chỉ với số lượng 4,68 lg (CFU / g). Có sự khác biệt trên có thể là do: Nguồn nguyên liệu lên men khác nhau, Phương pháp lên men khác nhau (nghiên cứu này tiến hành lên men trong thùng xốp trong khi nghiên cứu của Nielsen và cộng sự mẫu được lấy từ lên men trong thùng gỗ); và lượng mẫu dùng trong quá trình lên men khác nhau (khối lượng lên men của nghiên cứu này chỉ 3,5 kg) trong khi khối lượng lên men của các nghiên cứu khác rất lớn. 3. Định danh chủng vi khuẩn lactic tuyển chọn từ quá trình lên men ca cao tự nhiên. Các chủng vi khuẩn lactic phân lập từ các mẻ ca cao lên men tự nhiên được giữ lại. Qua kết quả trình bày ở trên, mẫu 12 là mẫu có chất lượng lên men tốt nhất, hy vọng chủng vi khuẩn lactic ở mẫu này có tác động tốt đến chất lượng hạt ca cao sau lên men. Chủng vi khuẩn lactic có số lượng chủ yếu phân lập được từ mẫu 12, ký hiệu LL12.1. Đặc điểm chủng LL12.1 được trình bày trong bảng 1, hình 7. Bảng 1. Đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hóa của chủng vi khuẩn lactic LL12.1 Đặc điểm Mô tả Hình dạng khuẩn lạc Hình hoa, có nhân hình tròn ở giữa, bề mặt bên ngoài nhám Hình thái tế bào que, dài Nhuộm Gram + Phản ứng catalase - Hình dạng khuẩn lạc Hình thái tế bào Hình 7. Hình thái tế bào của LL12.1 Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2013 122 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Sau khi định danh sơ bộ, tiến hành định danh LL12.1 bằng phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA Hình 8. Kết quả giải trình tự gen 16S của chủng LL12.1 Kết quả giải trình tự gen cho thấy chủng LL12.1 là Lactobacillus fermentum. IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận Qua quá trình nghiên cứu kết quả thu được mẫu 12 có chất lượng cao nhất trong 3 mẫu ca cao lên men tự nhiên. Mật độ vi khuẩn lactic tăng dần đều, đạt cao nhất sau 120 giờ lên men (lg CFU/g là 7,67), sau đó giảm lại ở cuối giai đoạn ủ. Sau 6 ngày ủ 97,3% số hạt lên men hoàn toàn, chỉ 2,7% lên men một phần. Kết quả định danh chủng vi khuẩn lactic LL12.1 từ mẻ ca cao lên men này là vi khuẩn Lactobacillus fermentum. 2. Kiến nghị Để khẳng định lại vai trò của chủng Lactobacillus fermentum LL12.1 đến chất lượng hạt ca cao sau lên men, cần nghiên cứu ảnh hưởng của việc bổ sung chủng vi khuẩn này đến chất lượng hạt ca cao sau quá trình lên men. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Trần Linh Thước, tái bản lần thứ 6. Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm, NXB Giáo dục, trang 65-66, 81-82. 2. TCVN 5165-1990, Sản phẩm thực phẩm, Phương pháp xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí. Tiếng Anh 3. D.S. Nielsen, O.D. Teniola, L. Ban-Koffi , M. Owusu, T.S. Và ersson, W.H. Holzapfel, 2007. The microbiology of Ghanaian cocoa fermentations analysed using culture-dependent and culture-independent method, international journal of food microbiology. International Journal of Food Microbiology. 168–186 4. Dennis Sandris Nielsen, 2007, The microbiology of Ghanaian cocoa fermentations, Department of Food Science, Food Microbiology, The Royal Veterinary and Agricultural University Denmark, ISBN 87-991713-1-7. 5. Nicholas Camu, Tom De Winter, Solomon K Addo, Jemmy S Takrama, Herwig Bernaert and Luc De Vuyst, 2008. Fermentation of cocoa beans: influence of microbial activities and polyphenol concentrations on the flavour of chocolate, Journal of the Science of Food and Agriculture J Sci Food Agric 88:2288–2297 6. Luc De Vuyst et al, 2010 , The Functional Role of Lactic Acid Bacteria in Cocoa Bean Fermentation, Biotechnology of Lactic Acid Bacteria Novel Applications. Biotechnology of Lactic Acid Bacteria Novel Applications, ISBN: 978-0-813-81583-1 7. Michael P. Doyle, Larry R.Beuchat, Thomas J. Montville, Food microbiology fundamentals and frontiers – cocoa and coffee. 8. T.F. Santos et al, 2011, Lactic acid bacteria dynamics during spontaneous fermentation of cocoa beans verifi ed by culture-independent denaturing gradient gel electrophoresis, Genet. Mol. Res. 10 (4): 2702-2709 (2011).