Sinh học - Chương 2: Polymerase chain reaction

Polymerase Chain Reaction Tp. Hồ Chí Minh 24-9-2014 Taq polymerase • DNA polymerase chịu nhiệt, dễ tinh sạch bằng nhiệt • Tổng hợp DNA theo chiều 5’  3’ • Exonuclease 5’  3’ • Tổng hợp 50 – 60 nu/s Taq polymerase • Không có hoạt tính sửa sai (proof-reading) – Tổng hợp sai 1/10.000 nu – Tạo sản phẩm PCR sai trình tự • Sản phẩm dài 2 – 4 kb • Bền nhiệt: 40 phút/95 oC, • Gắn thêm adenine (A) ở đầu 3’ của sản phẩm – Có ích khi tạo dòng bằng TA kit Enzyme bền nhiệt có hoạt tính sửa sai • Tli : Thermococcus litoralis – Bền ở 95 oC. Giữ hoạt tính sau 1h ở 95 oC • Pfu: Pyrococcus furiosus Thiết kế primer • Chiều dài – Ngắn: dễ bắt cặp  không chuyên biệt – Dài : Khó bắt cặp  chuyên biệt – 20 – 30 nu • Bắt cặp sai (mismatches) – Đầu 3’ của primer phải bắt cặp hoàn toàn với nu trên khuôn mẫu, thường sử dụng C/G (why ?) – Đầu 5’ của primer không cần bắt cặp hoàn toàn với khuôn mẫu  chèn trình tự nhận biết của RE Thiết kế primer • Nhiệt độ nóng chảy (Tm) – 2 mồi có nhiệt độ nóng chảy tương tự nhau  thành phần ATGC tương đương nhau • Cấu trúc thứ cấp nội tại – Tránh tự bắt cặp • Primer dimer: primer bắt cặp với nhau Thiết kế primer • Primer dimer: primer bắt cặp với nhau Thiết kế primer • Tránh thiết kế primer từ trình tự amino acid  why? • Tránh thiết kế primer từ các trình tự nucleotid hoặc amino acid liên quan – Tránh tự bắt cặp ( sử dụng trong cloning gene tương đồng) • Primer dimer: primer bắt cặp với nhau Ứng dụng 1. Giải trình tự DNA 2. Chẩn đoán - Xác định tính trạng di truyền - Phát hiện sinh vật gây bệnh - Phát hiện chất gây nhiễm thực phẩm 3. Pháp y 4. Đa dạng di truyền quần thể 5. Khảo cổ học và tiến hóa Cần quan tâm • Kích thước sản phẩm – Hỗn hợp enzyme (+ 1 proof-reading) sẽ tăng kích thước sản phẩm khoảng 10 kb. (Long-rang PCR) – Cần kéo dài thời gian cho long-rang PCR – Tuổi mẫu (chất lượng mẫu) tỉ lệ nghịch với kích thước khuếch đại của sản phẩm. • Khuếch đại sản phẩm sai trình tự – Primer bắt cặp khuếch đại đoạn không mong muốn (không đặc hiệu, nồng độ muối, nhiệt độ,) – Sử dụng primer đặc hiệu, tăng nhiệt độ bắt cặp, tăng Mg ion Cần quan tâm • Nhiễm lẫn – Vật dụng, thao tác, tác nhân sinh học trong phòng thí nghiệm – Thao tác cẩn thận, giữ sạch nơi thí nghiệm • Sản phẩm không đồng nhất – Mẫu không đồng nhất, đến từ nhiều nguồn khác nhau hoặc bị suy thoái (degradation) – Hiệu quả của enzyme polymerase Các loại PCR cải biến – tăng độ nhạy • Hot-start PCR – Giảm sự bắt cặp không đặc hiệu của primer  giảm khuếch đại sản phẩm không mong muốn. – Cho enzyme polymerase vào dung dịch khi đạt nhiệt độ bắt cặp tối thích. – Bọc enzyme hoặc muối Mg bằng sáp – Sử dụng antibody bất hoạt enzyme giai đoạn đầu. Các loại PCR cải biến – tăng độ nhạy • Touch-down PCR – Giảm sự bắt cặp không đặc hiệu của primer  giảm khuếch đại sản phẩm không mong muốn. – Nhiệt độ bắt cặp ban đầu cao tránh bắt cặp không đặc hiệu xảy ra, sau đó sẽ giảm đến nhiệt độ bắt cặp tối thích Các loại PCR cải biến – tăng độ nhạy • Nested-PCR Tăng độ chuyên biệt. Hard- copies Hard-copies Hard- copies Inverse PCR Reverse transcriptase PCR (RT-PCR) RT-PCR Quantitative PCR (qPCR) – Kết quả khuếch đại DNA thể hiện qua từng chu kỳ nhiệt – Sử dụng chất nhuộm phát huỳnh quang khi chèn vào trong sợi đôi DNA (ex: SYBER Green) – Hoặc sử dụng các đoạn đầu dò đặc hiệu mang chất phát huỳnh quang (ex: Taq man probe) Quantitative PCR (qPCR) Hệ thống SYBER Green Quantitative PCR (qPCR) Hệ thống Taqman probe PCR mỏ neo (anchored PCR) Các loại PCR khác • Multiplex – PCR • Mutagenesis • Asymmetric PCR • Isothermic amplification (Loop mediated isothermal amplification)