Nghiên cứu xác định đồng thời một số thuốc kháng sinh họ β-Lactam bằng kỹ thuật đo quang kết hợp với mạng noron nhân tạo - Nguyễn Thị Thu Thuý

Nguyễn Thị Thu Thúy và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 96(08): 97 - 102 97 NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI MỘT SỐ THUỐC KHÁNG SINH HỌ β-LACTAM BẰNG KỸ THUẬT ĐO QUANG KẾT HỢP VỚI MẠNG NORON NHÂN TẠO Nguyễn Thị Thu Thuý*, Nguyễn Xuân Chiến Trường Đại học Khoa học - ĐH Thái Nguyên TÓM TẮT Nghiên cứu xác định đồng thời một số thuốc kháng sinh họ β – lactam bằng phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử kết hợp với mạng nơron nhân tạo. Dữ liệu phổ được ghi trong khoảng bước sóng từ 190 – 250 nm. Mạng nơron nhân tạo gồm 3 lớp được luyện bởi thuật toán lan truyền ngược. Phương pháp đã được ứng dụng thành công trong việc xác định đồng thời amoxcillin (AMO), ampicillin (AMP), cloxacillin (CLO) trong một số mẫu thuốc và mẫu máu cho kết quả có độ lặp lại < 5% và sai số nhỏ nằm trong phạm vi cho phép cụ thể < 15%. Từ khoá: mạng nơron nhân tạo, lan truyền ngược, luyện mạng, β – lactam, kháng sinh. MỞ ĐẦU* Xác định dư lượng kháng sinh là một mảng đề tài rất thực tế và quan trọng. Đã có nhiều nghiên cứu xác định hàm lượng kháng sinh bằng các phương pháp kinh điển như phương pháp phổ hấp thụ phân tử, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. Tuy nhiên, phương pháp phổ hấp thụ phân tử thường gặp khó khăn khi phân tích hỗn hợp nhiều cấu tử mà phổ của chúng xen phủ nhau; bằng phương pháp HPLC có độ chính xác cao nhưng giá thành cao và khó thực hiện ở nhiều phòng thí nghiệm do thiết bị đắt. Gần đây, phương pháp mạng noron nhân tạo (ANN) là một phương pháp đang được phát triển và ứng dụng trong nhiều ngành, nhiều lĩnh vực. Trong công trình này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu, xác định đồng thời một số thuốc kháng sinh họ β- lactam bằng phương pháp phổ hấp thụ phân tử kết hợp với mạng nơrron nhân tạo. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng Đối tượng phân tích mà chúng tôi chọn để nghiên cứu là cloxacillin (CLO), ampicillin (AMP), amoxcillin (AMO), là các kháng sinh β-lactam được sử dụng phổ biến hiện nay. Các kháng sinh thuộc họ β – lactam này có * Tel: 0983 828880, Email: thuych1019@gmail.com thể tồn tại đồng thời trong nhiều đối tượng như: mẫu nước tiểu, mẫu máu của người bệnh... Trong công trình này, chúng tôi chọn mẫu thuốc và mẫu máu làm mẫu để phân tích. Phương pháp nghiên cứu Sử dụng phương pháp phổ hấp thụ phân tử để xác định đồng thời ba kháng sinh cloxacillin (CLO), ampicillin (AMP), amoxcillin (AMO). Trên cơ sở nghiên cứu chọn ra các điều kiện tối ưu về bước sóng, pH, ảnh hưởng của các kháng sinh khác. Kết hợp sử dụng phần mềm WinNN (Windows Neutral Network) được cung cấp bởi Danon Software. Phần mềm WinNN được thiết kế rất linh hoạt, số lớp mạng từ 3-5 lớp. Kích thước trong một lớp có thể lên đến 1024 nút. Số mẫu học cho phép tới 8192 mẫu. Trong công trình này, chúng tôi sử dụng phần mềm WinNN với cấu trúc mạng được chọn tối ưu nhất, số lớp được sử dụng trong mạng là ba lớp sử dụng thuật toán lan truyền ngược. Trong đó gồm 1 lớp đầu vào, 1 lớp ẩn, 1 lớp đầu ra. * Phân tích mẫu giả: Tiến hành chuẩn bị các mẫu với các điều kiện đã khảo sát, ghi phổ của các dung dịch mẫu trong khoảng bước sóng từ 190nm đến 300nm với bước dữ liệu là 1nm, dung dịch so sánh là mẫu trắng. Chuyển mã tín hiệu phổ sang mã ASCII (có trong phần mềm của thiết bị đo quang). Mạng cho một file kết quả có chứa hàm lượng của Nguyễn Thị Thu Thúy và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 96(08): 97 - 102 98 AMO, AMP, CLO mà mạng đã tính được dựa vào mối quan hệ của các cấu tử mạng đã học trước đó (bảng 2). Với 7 mức biến thiên như trên có thể tạo ra được 342 dung dịch mẫu là tổ hợp của các dung dịch chuẩn AMO, AMP, CLO có nồng độ như ma trận trên.. Trong đó chọn ngẫu nhiên 2/3 số mẫu trên dùng làm mẫu học và 1/3 mẫu dùng làm mẫu kiểm tra. * Phân tích mẫu thật: Trong đề tài này chúng tôi chọn mẫu huyết thanh và mẫu thuốc làm mẫu để phân tích. Dưới đây là qui trình xử lý mẫu. - Qui trình xử lý mẫu huyết thanh: Lượng mẫu lấy từ 75 đến 100 µl vào mao quản có phủ chất heparin chống. Loại bỏ protein bằng cách kết tủa nó với etanol tuyệt đối, thêm 500 µl n-hexan và li tâm riêng biệt hai lớp. Hút 100µl dịch chiết n-hexan rồi làm bay hơi bằng nitơ sạch đến hết dung môi. Cặn được hòa tan trong 500 µl dung dịch đệm photphap pH = 7,4. - Qui trình xử lý mẫu thuốc: Các mẫu thuốc Amo, Amp,Clo thuộc công ty cổ phần dược trung ương II. Với mỗi mẫu thuốc lấy 6 viên nghiền mịn bằng cối mã não, sau đó trộn đều để lấy khối lượng trung bình và dùng làm mẫu lưu. Mỗi viên có hàm lượng là 500mg. Tiến hành ghi phổ trong khoảng bước sóng 190-250nm với dung dịch so sánh là dung dịch mẫu trắng. Bộ dữ liệu thu được xử lý và tiến hành xác định bằng phần mềm WinNN. Kết quả được trình bày trong bảng 6, 7. THỰC NGHIỆM Khảo sát các điều kiện tối ưu xác định đồng thời β-Lactam bằng phổ hấp thụ phân tử trong vùng UV Khảo sát phổ hấp thụ của β-Lactam Kết quả phổ ghi được của ba kháng sinh AMO, AMP, CLO được trình bày bảng 1. Bảng 1: Độ hấp thụ quang của các dung dịch tại bước sóng cực đại Chất phân tích Bước sóng hấp thụ cực đại (nm) Độ hấp thụ AMO 196 1,088 AMP 194 0,939 CLO 196 0,884 Hỗn hợp( AMO, AMP, CLO) 196,4 1,762 Nghiên cứu ảnh hưởng của pH Tiến hành khảo sát hai loại dung dịch đệm photphat và dung dịch đệm borat. Kết quả chỉ ra ở hình 1 và hình 2. Hình 1: Ảnh hưởng của dung dịch đệm photphat Hình 2: Ảnh hưởng của dung dịch đệm tetraborac Qua quá trình khảo sát thì dung dịch đệm photphat cho độ hấp thụ quang của dung dịch cao nhất tại pH=7,4 và đệm tetraborat cho độ hấp thụ quang cao nhất tại pH = 8,5. Vì các kháng sinh này kém bền trong môi trường axit và kiềm. Mặt khác, đệm photphat là dung dịch đệm cópH ổn định, bền lâu hơn so với dung dịch đệm tetraborat. Do vậy, chúng tôi chọn dung dịch đệm photphat pH = 7,4 để khảo sát các thí nghiệm tiếp theo. 0.8 1 1.2 5 6 7 8 9Đ ộ hấ p th ụ qu an g pH CLO AMO AMP 0.7 0.8 0.9 1 5 6 7 8 9 10 Đ ộ hấ p th ụ qu an g pH AMO AMP CLO Nguyễn Thị Thu Thúy và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 96(08): 97 - 102 99 Khảo sát sự ảnh hưởng của các kháng sinh khác thuộc họ β-Lactam Khảo sát ảnh hưởng của một số kháng sinh thường gặp là benzyl penicillin, oxacillin thuộc cùng nhóm với CLO và cephadroxil. Làm thí nghiệm với các mẫu có nồng độ benzyl penicillin, oxacillin và cephadroxil thay đổi tăng dần ở giá trị pH bằng 7,4. Kết quả được chỉ ra ở hình 3, 4,5 Hình 3. Sự ảnh hưởng của benzyl penicillin đến độ hấp thụ quang dung dịch AMO, AMP, CLO Hình 4. Ảnh hưởng của oxacillin thêm vào dung dịch AMO, AMP, CLO Hình 5. Ảnh hưởng của cephadroxil thêm vào dung dịch AMO, AMP, CLO Như vậy từ kết quả thu được qua 3 bảng ở trên thì thấy rằng ở nồng độ thấp (khoảng dưới 5 ppm) cuả benzyl penicillin, Oxacillin và Cephadroxil khi có mặt trong từng dung dich AMO, AMP, CLO thì ảnh hưởng không đáng kể. Kết quả phân tích mẫu giả Kết quả chỉ ra ở bảng 3, bảng 4, bảng 5. Bảng 2: Ma trận nồng độ các cấu tử khảo sát STT Nồng độ (µg/25ml) AMO AMP CLO 1 0,00 0,00 0,20 2 0,20 0,50 0,50 3 0,50 1,00 2,00 4 4,00 4,00 4,00 5 8,00 6,00 8,00 6 10,00 10,00 10,00 7 14,00 14,00 14,00 0.7 1.7 2.7 0 5 10 15 20 25 30 35Đ ộ hấ p th ụ qu a n g AMO AMP CLO 0.7 1.2 1.7 0 5 10 15 20 25 30 35 Đ ộ hấ p th ụ qu an g AMO AMP CLO 0.7 1.2 1.7 0 5 10 15 20 25 30 35 Đ ộ hấ p th ụ qu an g Nồng độ µg/25ml AMO AMP CLO Nguyễn Thị Thu Thúy và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 96(08): 97 - 102 100 Bảng 3. Kết quả xác định AMO trong các dung dịch hỗn hợp ST T Hàm lượng AMO, AMP, CLO trong hỗn hợp (µg/25ml) n Hàm lượng AMO xác định được AMO (AMP-CLO) 1 0 (0-1), (0-5), (1-10), (5-1), (5-10), (5-15), (10-10) 7 0,05 ± 0,02 2 0,2 (0-5), (0-15), (0,2-5), (0,2-10), (0,2-15), (0,5-10), (0,5-15), (1-15) 8 0,19 ± 0,01 3 0,5 (0,5-6), (4-6), (4-10), (8-14), (8-18), (10-10), (10-14), (14-0,5), (14-0,5) 9 0,52 ± 0,01 4 4 (0,5-14), (0,5-18), (4-6), (4-10), (8-6), (8-10), (10-10), (14-0,5), (14-6) 9 3,98 ± 0,19 5 8 (0,5-10), (2-2), (6-6), (6-10), (2-10) (10-5),(10-10) 7 7,96 ± 0,26 6 10 (0,5-2), (4-6), (4-8), (6-2), (6-10), (8-6),(10-2) 7 10,05 ± 0,36 7 14 (0,5-2), (0,5-4), (4-1), (6-2), (6-8), (8-2), (10-0,5), (10-2) 8 14,08 ± 0,28 Bảng 4. Kết quả xác định AMP trong các dung dịch hỗn hợp T T Hàm lượng AMO, AMP, CLO trong hỗn hợp (µg/25ml) n Hàm lượng AMP xác định được AMP (AMO-CLO) 1 2 3 4 5 6 7 0 0,2 0,5 1 2 4 5 (0,5-5), (0,2-15) (0,2-5), (0,2-10), (0,2-15) (0,2-10), (0,2-15), (0,5-6), (4-14), (4-18), (8-10), (10-2), (14-2), (14-4) (0-1), (0-5), (0-10), (0,2-15) (8-2), (8-10) (0,5-6), (0,5-10), (4-6), (4-10), (10-6), (10-8), (14-1) (0-1), (0-10), (0-15) 2 3 9 4 2 7 3 0,00 ± 0,04 0,20 ± 0,01 0,50 ± 0,03 1,01 ± 0,04 2,02 ± 0,07 3,93 ± 0,17 4,96 ± 0,16 Bảng 5. Kết quả xác định CLO trong các dung dịch hỗn hợp TT Hàm lượng AMO, AMP, CLO trong hỗn hợp (µg/25ml) n Hàm lượng CLO xác định được CLO (AMO-AMP) 1 2 0,5 1 (0,5-14), (4-14), (14-10) (0-1), (0-5), (14-4) 3 3 0,05±0,01 0,99±0,05 3 4 5 6 7 2 4 5 6 8 (8-2), (10-0,5), (10-6), (10-10), (14-0,5), (14-6), (14-8), (0,5-14), (14-0,5) (0-1), (0,2-0), (0,2-0,2), (8-10) (0,5-0,5),(0,5-4), (4-4), (4-8), (4-14),(8-6), (10-4), (10-8) (14-4), (14-6) 8 2 3 8 2 2,04 ± 0,11 4,16 ± 0,01 5,08 ± 0,15 5,90 ± 0,22 7,91 ± 0,02 Kết quả từ bảng 3, 4 và 5 cho biết giá trị trung bình của AMO, AMP và CLO với độ lệch chuẩn thu được trong hỗn hợp có độ chính xác khá cao. Kết quả phân tích mẫu thật Kết quả phân tích mẫu thật được trình bày trong bảng 6, 7 Bảng 6. Kết quả xác định các chất kháng sinh trong mẫu thuốc Tên mẫu Hàm lượng ghi trên nhãn (mg) Hàm lượng tìm thấy (mg) Tỉ lệ tìm thấy (%) Ampicillin 500 505,64 102,63% Amoxicillin 500 507,3 101,48% Cloxin (Cloxacillin) 500 482,04 96,45% Nguyễn Thị Thu Thúy và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 96(08): 97 - 102 101 Bảng 7. Kết quả xác định các chất kháng sinh trong mẫu huyết thanh STT Tên mẫu huyết thanh AMO (µg/ml) AMP (µg/ml) CLO(µg/ml) 1 Mẫu 1 1,39 0 S= 0,01; RSD=1,01% 2 Mẫu 2 0,55 0,82 0 S=0,01; RSD=1,78% S=0,02;RSD=2,34% 3 Mẫu 3 0 1,12 0 S=0,01;RSD=0,83% 4 Mẫu 4 0,50 0 S=0,01;RSD=2,36% Từ kết quả trên cho thấy: kết quả định lượng AMO, AMP, CLO trong mẫu thuốc và mẫu huyết thanh cho độ lặp tương đối tốt. Độ lệch chuẩn tương đối thu được của các mẫu thật đều ở khoảng 2%. Sai số lớn nhất 2,92% , nằm trong phạm vi cho phép của phân tích hàm lượng cấp ppm. KẾT LUẬN Công trình này đã thu được một số kết quả như sau: 1. Đã nghiên cứu khảo sát các điều kiện tối ưu để xác định đồng thời AMO, AMP, CLO trong cùng hỗn hợp bằng phương pháp phổ hấp thụ phân tử: - Khảo sát phổ hấp thụ cực đại của các kháng sinh họ β-lactam : AMO có cực đại 196 nm; AMP có cực đại hấp thụ 194 nm và CLO có cực đại 196 nm; - Chọn được dung dịch đệm photphat với pH tối ưu cho quá trình khảo sát là pH = 7,4. - Khoảng tuyến tính của: AMO là 0,2ppm- 15ppm; AMP 0,2-15 ppm; CLO là 0,2-18 ppm 2. Nghiên cứu ảnh hưởng của các kháng sinh khác thuộc họ β-lactam đến quá trình phân tích đồng thời hỗn hợp AMO, AMP, CLO. Ở nồng độ thấp (khoảng dưới 5 ppm) cuả benzyl penicillin, Oxacillin và Cephadroxil thì có ảnh hưởng không đáng kể. 3. Xác định được đồng thời AMO, AMP, CLO trong mẫu nhân tạo sử dụng mạng nơron nhân tạo bằng phần mềm WinNN 4. Xác định được đồng thời AMO, AMP, CLO trong mẫu huyết thuốc và mẫu huyết thanh TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Belal F., El – Kerdawy M. M., El-Ashry S. M., El – Wasseef D. R. (2000), “Spectrophotometric determination of ampicillin and amoxicillin in dosage forms”, Il Farmaco 55, 680-686. [2]. Saidul Zafar Qureshi., Talat Qayoom., marud I. Helalet. (1999), “Simultaneous spectrophotometric and volumetric derterminations of amoxycillin, ampicillin and cloxacillin in drug formulation: reaction mechanism in base catalysed hydrolysis followed by oxidation with iodate in dilute acid solution”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 21, pp. 473-482. [3]. Tạ Thị Thảo (2005), Bài giảng chuyên đề thống kê trong hóa phân tích, ĐH Quốc gia Hà Nội Nguyễn Thị Thu Thúy và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 96(08): 97 - 102 102 SUMMARY STUDY ON OPTICAL MEASUREMENT TECHNIQUES FOR SIMULTANEOUS DETERMINATION OF SOME β – L ACTAM ANTIBIOTICS COMBINING ARTIFICIAL NEURAL NETWORKS Nguyen Thi Thu Thuy*, Nguyen Xuan Chien College of Science - TNU The study on molecular absorption spectrometry for simultaneous determination of some β – lactam antibiotics combining artifical neural networks was carried out. The absorption data were base on the spectra registered in range of 190 – 250 nm. An artificical neural networks consisting of three layers was trained by applying a back – propagation learning rule. The method has been sucessfuly applied for the simultaneous determination of AMO, AMP, CLO in real drugs samples and bloods samples with have satisfactory repeats results < 5% and low erro in permitting < 15%. Key words: artifical neural networks, back – propagation, trained, β – lactam, antibiotics * Tel: 0983 828880, Email: thuych1019@gmail.com