Nghiên cứu phân lập và khả năng phân hủy một số hydrocacbon thơm đa nhân (PAHS) của chủng vi khuẩn BQN31

T¹p chÝ Khoa häc & C«ng nghÖ - Sè 2(46) Tập 2/N¨m 2008 61 NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY MỘT SỐ HYDROCACBON THƠM ĐA NHÂN (PAHs) CỦA CHỦNG VI KHUẨN BQN31 Lê Tiến Mạnh (Trường ĐH Sư phạm-ĐH Thái Nguyên) Nghiêm Ngọc Minh (Viện Công nghệ Sinh học) 1. Mở đầu Hydrocarbon thơm đa nhân (PAH) và các hợp chất hữu cơ khó phân hủy (POP) là các chất độc tồn tại ở môi trường sinh thái [1]. Sự phát triển của công nghiệp, đặc biệt là công nghiệp luyện kim, dầu khí, sản xuất giấy, chất diệt cỏ đã kéo theo sự ô nhiễm PAHs và POP. Hydrocarbon thơm đa nhân được biết đến như là hợp chất gây ô nhiễm nguy hiểm cho môi trường. Ngoài ra chúng còn là hợp chất gây ô nhiễm, gây nên ung thư và là tác nhân đột biến đối với con người, đặc biệt là các PAHs có trọng lượng phân tử cao (4 benzene trở lên). Hợp chất hydrocarbon thơm đa nhân là những chất hoá học hữu cơ có cấu trúc từ 2 - 6 vòng benzene, có khả năng hoà tan trong nước và khả năng này giảm khi số lượng vòng benzene tăng lên. Khả năng hoà tan trong nước thấp nhưng hệ số hấp phụ, khả năng bám dính cũng như khả năng hoà tan trong mỡ động vật cao. PAHs còn có khả năng thNm thấu và tích tụ trong trầm tích đặc biệt là trầm tích biển và cặn, đó cũng là nguyên nhân ảnh hưởng rất nhiều tới khả năng phân hủy sinh học của vi sinh vật đối với hợp chất này [2]. Các hợp chất này thâm nhập gián tiếp vào cơ thể con người thông qua chuỗi thức ăn, đường hô hấp hoặc tiếp xúc trực tiếp với nguồn ô nhiễm gây nên tác hại cho con người như ung thư, đột biến. Trong tự nhiên, các hợp chất PAHs không tồn tại ở trạng thái đơn lẻ mà tồn tại ở dạng hỗn hợp. Nhiều tập đoàn và các chủng vi sinh vật như vi khuNn, xạ khuNn, nấm có khả năng phân hủy mạnh PAH từ nhiều nguồn ô nhiễm đã được phân lập, nghiên cứu như đại diện của các chi Pseudomonas. Mycobacterium, Corylbacterium, Aeromonas, Rhodococus và Bacillus v.v. Cho đến nay cũng đã có nhiều chủng vi khuNn phân hủy PAHs như là nguồn cacbon và năng lượng duy nhất đã được công bố, tuy nhiên tốc độ phân hủy PAH bởi chủng sạch và so với tốc độ phân hủy thực sự ở môi trường rất khó xác định [3]. Đã có nhiều công bố của các tác giả trong nước cũng như ngoài nước về khả năng phân hủy các PAH của các chủng vi sinh vật được phân lập từ các nguồn khác nhau. Năm 2000, Nguyễn Bá Hữu và cộng sự đã phân lập được 7 chủng vi khuNn từ mẫu bùn cát tại Khe Chè, Quảng Ninh trong đó chủng vi khuNn KCP8 có khả năng chuyển hóa 6 loại PAH sau 7 ngày nuôi cấy [10]. Chủng vi khuNn Sphingomonas yanoikuyae MXL-9 của tác giả La Thị Thanh Phương phân lập từ cặn dầu thô khai thác từ mỏ Bạch Hổ cũng thể hiện khả năng phân hủy Phenanthren và Anthracen [9]. Trong bài báo này, chúng tôi trình bày kết quả nghiên cứu một số đặc điểm sinh học, khả năng chuyển hóa PAHs của tập đoàn vi khuNn và chủng vi khuNn BQN31 phân lập từ khu đất, nước nhiễm dầu và thuốc nổ TNT ở mỏ than Quảng Ninh. 2. Nguyên liệu và phương pháp 2.1. Nguyên liệu nghiên cứu Nguyên liệu được sử dụng trong nghiên cứu là chủng vi khuNn BQN31 được phân lập từ khu đất và nước nhiễm dầu và thuốc nổ TNT ở mỏ than Quảng Ninh. 2.2 Phương pháp nghiên cứu T¹p chÝ Khoa häc & C«ng nghÖ - Sè 2(46) Tập 2/N¨m 2008 62 Chủng vi khuNn được phân lập theo phương pháp làm giàu. Hút 5ml nước ô nhiễm dầu chuyển vào bình nuôi cấy dung tích 250ml chứa 45ml môi trường muối khoáng, các PAHs và một số nguyên tố vi lượng khác. Sau 4 – 5 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 30oC và lắc ở 200v/phút, 5ml dịch nuôi cấy được chuyển sang bình nuôi cấy mới ở cùng điều kiện thí nghiệm. Sau 3 lần làm giàu trên nguồn carbon là PAH, các chủng vi sinh vật được phân lập theo phương pháp tới hạn. Nghiên cứu đặc điểm hình thái chủng BQN31 dựa trên việc quan sát đặc điểm màu sắc, kích thước khuNn lạc, đặc điểm phát triển trên môi trường thạch và trên kính hiển vi điện tử quét JSMLV5410 ở độ phóng đại 15000 lần, với sự cộng tác của Viện 69, Bộ Tư lệnh Lăng. Phương pháp xác định khả năng chuyển hóa PAHs là phương pháp đo quang phân tử UV-VIS: GBC - CINTRA 4. Dịch nuôi cấy vi sinh vật sử dụng PAH (20 ml) được chiết bằng 180 ml cồn tuyệt đối, sau đó lọc toàn bộ, thu dịch lọc đưa đi phân tích. Nồng độ của mỗi PAH trước và sau xử lý được tính toán dựa vào chiều cao Pic hấp thụ tại các bước sóng: Pyren 340 nm; Fluoren, Fluoranthen, Phenanthren, Anthracen, Naphtalen: 205 nm. 3. Kết quả và thảo luận Phân lập vi khu n Vi sinh vật (VSV) sử dụng PAHs được phân lập theo phương pháp làm giàu trên môi trường muối khoáng chứa các nguồn PAHs như là nguồn cacbon và năng lượng duy nhất. Kết quả phân lập cho thấy VSV sử dụng PAHs trong mẫu đất và nước nhiễm dầu không đa dạng, trên mỗi loại PAH chỉ có từ 1 đến 5 loại khuNn lạc, trong đó loại vi khuNn có mầu trắng, trơn, lồi bóng và nhỏ chiếm ưu thế. Khả năng phân hủy PAHs được đánh giá sơ bộ bằng sự thay đổi mầu môi trường. Kết quả được trình bày ở bảng 1. Bảng 1: Số lượng vi khu n phân lập được và khả năng chuyển hoá PAHs TT Môi trường chứa PAHs và hỗn hợp PAHs Số lượng vi khuNn phân lập và khả năng chuyển hoá PAHs Mẫu nước Mẫu đất Khả năng phát triển Khả năng phát triển Mạnh Trung bình Yếu Mạnh Trung bình Yếu 1 Phenanthrene 1 3 1 - - 3 2 Anthracene - - 4 - - 1 3 Fluorene + Fluoranthene - - 1 - - 3 4 Pyrene + Chrysene - - 3 - - 1 5 Naphtalene - - 2 - - 2 Chú thích: Phát triển mạnh (môi trường đổi mầu sau 1 ngày); Phát triển trung bình (môi trường đổi mầu sau 3 ngày); Phát triển yếu (môi trường không đổi mầu sau 7 ngày). Kết quả bảng 1 cho thấy ở trên hai mẫu đất, nước nhiễm dầu và trên tất cả các PAHs đều có sự xuất hiện của các khuNn lạc, đặt biệt là mẫu nước với 4 loại khuNn lạc có khả năng phát triển khá mạnh (đổi màu môi trường sau 1-3 ngày). Sự tồn tại của các vi khuNn bản địa này cho thấy tiềm năng áp dụng công nghệ phân hủy sinh học vào xử lý ô nhiễm dầu và PAH sẽ mang lại hiệu quả cao. T¹p chÝ Khoa häc & C«ng nghÖ - Sè 2(46) Tập 2/N¨m 2008 63 Trong 25 chủng vi khuNn được phân lập trên các nguồn PAHs khác nhau ở bảng 2 thì 4 chủng trên nguồn Phenanthren ở mẫu đất là BQN30, BQN31, BQN32, BQN33 có khả năng phân hủy mạnh hơn cả. Môi trường nuôi cấy chuyển mầu vàng nâu và một trong số 4 chủng đó là BQN31 phân hủy mạnh nhất, môi trường đổi màu chỉ sau một 32h. Các chủng vi khuNn còn lại chuyển hóa ở mức độ yếu hơn, thấy có ít sinh khối vi sinh vật, môi trường không đổi mầu hoặc đổi màu sau nhiều ngày. Các kết quả sơ bộ về đặc điểm hình thái được trình bày ở bảng 2. Bảng 2. Đặc điểm hình thái của các chủng vi khu n TT Chủng vi khuNn Đặc điểm khuNn lạc trên môi trường muối khoáng + PAH 1 BQN30 Tròn, trơn, trắng trong 2 BQN31 Tròn, trơn, bóng, lồi, trắng đục, ánh xanh 3 BQN32 Tròn, trơn, ánh vàng 4 BQN33 Tròn, trơn, bóng, ánh xanh Chủng BQN31 đã được chọn để nghiên cứu và xác định khả năng phân hủy hydrocarbon thơm đa vòng. Đặc điểm hình thái chủng vi khu n BQN31 Chủng vi khuNn BQN31 được nuôi cấy trên môi trường muối khoáng bổ sung hydrocacbon thơm Phenanthren ở nhiệt độ 30oC, sau 3-5 ngày tiến hành quan sát đặc điểm hình thái. KhuNn lạc chủng BQN31 hình tròn, trắng, trơn, lồi, bóng, có ánh xanh, kích thước khoảng 1-2 mm (hình 2). Chụp dưới kính hiển vi điện tử quét JEOL 5410 LV, chúng có hình que, bề mặt tương đối nhẵn và kích thước 0,29 - 0,5 µm x 0,95 - 1,1µm (hình 1). Hình 1: Hình thái tế bào vi khu n BQN31 trên kính hiển vi điện tử quét JEOL 5410 LV với độ phóng đại 15.000 lần Hình 2: Hình thái khu n lạc BQN31 Khả năng sử dụng các loại PAH của chủng vi khu n BQN31 Trong môi trường tự nhiên PAHs thường tồn tại ở dạng hỗn hợp và rất độc, do đó việc đánh giá khả năng phân hủy các PAH bởi các chủng vi sinh vật bản địa có ý nghĩa rất quan trọng trong quá trình làm sạch ô nhiễm dầu nói chung và PAH nói riêng. Vì vậy chúng tôi đã tiến hành nuôi cấy chủng BQN31 trên môi trường muối khoáng với các PAHs là nguồn cacbon và năng lượng duy nhất, kèm theo với các mẫu đối chứng không bổ sung vi sinh vật. Dưới đây là phổ UV đo khả năng chuyển hoá phenanthren của chủng đơn BQN31 sau 5 ngày nuôi lắc trên môi trường khoáng ở nhiệt độ 30oC. T¹p chÝ Khoa häc & C«ng nghÖ - Sè 2(46) Tập 2/N¨m 2008 64 PAH Phổ UV Hình ảnh kiểm chứng Phenanthr en Từ những kết quả phân tích bằng phương pháp đo quang phân tử UV-VIS, khả năng phân hủy 5 loại PAHs khác nhau của chủng BQN31 được tổng hợp lại trong bảng 3. Bảng 3: Khả năng sử dụng các PAHs khác nhau của chủng BQN31 TT Loại PAH (nồng độ 100ppm) Hiệu suất chuyển hoá (%) Sự thay đổi màu môi trường nuôi cấy 1 Phenanthren 60,24 Môi trường chuyển màu vàng nâu 2 Fluoren 18,52 Môi trường chuyển màu vàng nhạt 3 Pyren 18,75 Môi trường chuyển màu nâu nhạt, ánh vàng 4 Naphthalen 69,38 Môi trường chuyển màu vàng 5 Anthracen 25,90 Môi trường chuyển màu nâu Các mẫu nuôi có vi sinh vật được nuôi cấy và phân tích song song cùng với mẫu đối chứng không có vi sinh vật bằng UV - VIS. Kết quả cho thấy, với tất cả các PAHs khác nhau, môi trường đều đổi màu và với mỗi loại PAHs thì màu môi trường khác nhau. Dựa trên kết quả phân tích ta thấy, chủng BQN31 có khả năng sử dụng tất cả các loại PAHs: 69,38% Naphthalene, 60,24% Phenanthren, 18,52% Fluoren, 25,9% Anthracen và 18,75% Pyren với nồng độ ban đầu 100ppm mỗi PAHs và sau 5 ngày nuôi cấy. Khả năng phân hủy của chủng BQN31 với Naphthalen là cao nhất và Fluoren là thấp nhất. Trên thế giới và ở Việt Nam cũng đã có nhiều công trình nghiên cứu khả năng phân hủy PAHs của các chủng vi sinh vật khác nhau. Weissenfels và đồng tác giả (1991) đã công bố chủng Alcaligenes denitrficans WW1 phân hủy fluoranthen rất mạnh với tốc độ 300mg/l mỗi ngày, đồng thời có khả năng đồng trao đổi chất với các loại PAHs khác như pyrene, benzo(a)anthracene [6]. Chủng Mycobacterium sp. PYR-1 phân hủy 74% hỗn hợp PAH gồm phenanthrene, anthracene, fluoranthene, pyrene, chrysene và benzo(a)pyrene sau 7 ngày nuôi cấy. Trong đó 95% fluoranthren bị loại bỏ sau 24h nuôi cấy, tuy nhiên nồng độ ban đầu chỉ có 17 mg/l [5]. Hiện nay, có nhiểu công bố về khả năng phân hủy fluoranthen và pyren của các chủng xạ khuNn thuộc các chi Gordonia, Mycrobacterium như là nguồn cacbon và năng lượng duy nhất [6]. Trong một nghiên cứu khác về khả năng phân hủy hỗn hợp PAH tại Khe Chè của Đặng Thị CNm Hà và cộng sự cho thấy tập đoàn vi khuNn KCa-VKm phân hủy 32% hỗn hợp PAH trong đó tập đoàn này đã phân hủy 77,84% phenanthren, 14,02% anthracen và 2,6% fluoranthen [7]. Chủng vi khuNn Sphingomonas yanoikuyae MXL-9 phân lập từ cặn dầu thô mỏ Bạch Hổ phân hủy 64,5% phenanthrece và 61,4% anthracene sau 7 ngày nuôi cấy ở nồng độ thấp [9]. mẫu K BQN31 T¹p chÝ Khoa häc & C«ng nghÖ - Sè 2(46) Tập 2/N¨m 2008 65 Hoàng Thị Mỹ Hạnh và đồng tác giả đã phân lập và nghiên cứu khả năng sử dụng PAH của chủng nấm Aspergillus sp. FVX5 phân lập từ khu xử lý làm sạch cặn dầu thô của tàu Chí Linh. Chủng nấm này có khả năng phân hủy 266,69 mg/l phenanthren, 33,34 mg/l anthracen, 19,16 mg/l fluoranthen sau 7 ngày nuôi cấy [8]. Chủng KCP8 của Nguyễn Bá Hữu và cộng sự phân lập tại Khe Chè có khả năng phân hủy hỗn hợp PAH (phenanthren, anthracen và fluoranthen) sau 7 ngày nuôi lắc ở môi trường muối khoáng là 76,12%, trong đó khả năng phân hủy phenanthren trong hỗn hợp là 79.96%, anthracen là 71,09% và fluoranthen là 41,01% [11]. Chủng Rhodococcus sp. được phân lập từ mẫu trầm tích có khả năng phân hủy 53% anthracene sau 24h ở nồng độ 3µg/ml [3]. Từ các kết quả trên chúng tôi đánh giá chủng BQN31 có khả năng phân hủy trung bình so với khả năng phân hủy các PAH đã công bố. 4. Kết luận Đã phân lập được 25 chủng vi khuNn có khả năng sử dụng các nguồn PAH với mức độ khác nhau, trong đó chủng BQN31 có khả năng phân hủy mạnh nhất. Chủng BQN31 có hình tròn, màu trắng, trơn, lồi, bóng có ánh xanh, kích thước khoảng 1-2 mm. Tế bào vi khuNn BQN31 có hình que, bề mặt tương đối nhẵn, kích thước 0,29 - 0,5 µm x 0,95 - 1,1µm. Chủng BQN31 có khả năng sử dụng 5 loại PAHs với khả năng phân hủy là: 69,38% Naphthalene, 60,24% Phenanthrene, 18,52% Fluorene, 25,9% Anthracene và 18,75% Pyrene với nồng độ ban đầu 100ppm mỗi PAHs và sau 5 ngày nuôi cấy
Tóm tắt Vi khuNn là một trong các nhóm vi sinh vật đóng vai trò quan trọng trong phân hủy sinh học các chất hữu cơ. Một số đại diện của các chi vi khuNn có khả năng phân hủy hydrocarbon thơm đa nhân (PAH - Polycyclic Aromatic Hydrocacbon) gần đây đã được công bố. Chủng vi khuNn BQN31 đã được phân lập tại khu đất nhiễm dầu và thuốc nổ TNT ở mỏ than Quảng Ninh có khuNn lạc tròn, màu trắng, trong, lồi, bóng, ánh xanh kích thước từ 1 - 2 mm. Dưới kính hiển vi điện tử quét chủng vi khuNn BQN31 có hình que, bề mặt tương đối nhẵn, kích thước 0,29 - 0,5 µm x 0,95 - 1,1µm. Chủng này có thể sử dụng nhiều loại hydrocarbon thơm đa vòng như Phenanthren, Anthracen, Naphthalen, Fluoren, Pyren trong đó Naphthalen bị phân hủy 69,38%, Phenanthren 60,24%, Fluoren 18,52%, Anthracen 25,9% và Pyren là 18,75% với nồng độ ban đầu 100ppm mỗi PAH và sau 5 ngày nuôi cấy. Từ khoá: Hydrocacbon thơm đa nhân, Phân huỷ sinh học. Summary Study on isolation and ability of polycyclyc aromatic hydrocarbons degradation of bacterium strain BQN31 Bacteria is one group of microorganism which have important role in bioremediation of organic matters. Some representatives of bacterium genus which are capable of polycyclic aromatic hydrocarbon (PAHs) degradation have been published recently. A bacterium strain – BQN31 which was isolated from oil and TNT contaminated soil in Quang Ninh, has round, T¹p chÝ Khoa häc & C«ng nghÖ - Sè 2(46) Tập 2/N¨m 2008 66 transparent, convex, smooth colonied, it’s colony size is 1-2 mm. Obserration of BQN31 using SEM (scan electrograplus microscopy) showed that BQN31 cells have smooth surface and bean shape and 0,29 - 0,5 µm width x 0,95 - 1,1µm length. The strain BQN31 is able to degrade 5 PAHs: Phenanthrene, Anthracene, Fluoranthene, Naphthalene, Fluorene, Pyrene in different levels, in which Naphthalene 69,38%, Phenanthrene 60,24%, Fluorene 18,52%, Anthracene 25,9% and Pyrene 18,75% with initial concentration of each PAHs is 100ppm after 5 days. Keywords: Polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH), Bioremediation. Tài liệu tham khảo [1] Ahlborg UG, Burouwer A, Fingerthut MA, Jacobson SW, Kennerdy SW, Kettrup AAF, Koeman JH, Poiger H, Rappe C, Safe SH, Seegal RF, Tuomisto J, Van Den BM (1992). Impact of polychlorinated dibenzo-p-dioxin, dibenzofurans and biphenyls on human and environmental health, with spencial emphasis on applicationof the toxic equivalency factor concept. Eur J Pharmacol 228: 179 – 199. [2] Ahn Y, Sanseverino J, Sayler GS (1999). Analyses of polycyclic aromatic hydrocarbon- degrading bacteria isolated from contaminated soil. Biodegradation 10: 149-157. [3] Deborah D, Moody J, Cerniglia CE (2002). Utilization of mixtures of polycyclic aromatic hydrocarbon by bacteria isolated from contaminated sediment. FEMS microbial Ecol 41: 1-7. [4] Johnsen AR, Wick LY, Harms H (2005). Principles of microbial PAH degradation in soil. Environ Poll 133: 71-84. [5] Moody DJ, Freeman PJ, Doerge RD, Cerniglia EC (2001). Degradation of phenanthrene and anthracene by cell suspensions of Mycobacterium sp. Strain PYR-1. Appl Environ Microbiol 67: 1476- 1483. [6] Weissenfels WD, Beyer M, Klein J (1991). Degradation of phenanthrene, fluorine and fluoranthene by oure bacteria cultures. Appl Microbial Biotechnol 32: 479-484. [7] Đặng T. CNm Hà và cộng sự (2002). Nghiên cứu làm sạch ô nhiễm dầu mỏ bằng phân hủy sinh học (Bioremediation), Báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ KHCN 02-12. [8] Hoàng Thị Mỹ Hạnh, Nguyễn Đương Nhã, Đặng Thị CNm Hà (2003). "Nấm sợi phân huỷ hydrocarbon thơm đa nhân phân lập từ cặn dầu thô của giếng khai thác dầu, Vũng Tàu". Tạp chí Công nghệ sinh học, 1: 255-264. [9] La Thị Thanh Phương, Nguyễn Bá Hữu, Đặng Thị CNm Hà (2003). "Phân hủy sinh học hydrocarbon thơm đa nhân (PAHs) bởi chủng vi khuNn MXL-9 phân lập từ cặn dầu thô của mỏ Bạch Hổ Vũng Tàu". Tạp chí Công nghệ Sinh học 1(1): 109-117. [10] Nguyễn Bá Hữu. Nghiên cứu các nhóm vi sinh vật và khả năng phân huỷ hydrocarbon thơm đa nhân của một số chủng vi khu n trong quá trình xử lý ô nhiễm dầu tại Khe Chè, Quảng Ninh. Luận văn thạc sĩ sinh học, Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật, 2002