Khả năng kháng vi khuẩn vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính của tôm he Ấn Độ (penaeus indicus) - Hoàng Tùng

72 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2017 THOÂNG BAÙO KHOA HOÏC KHẢ NĂNG KHÁNG VI KHUẨN Vibrio parahaemolyticus GÂY BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY CẤP TÍNH CỦA TÔM HE ẤN ĐỘ (Penaeus indicus) RESISTANCE OF INDIAN SHRIMP Penaeus indicus TO THE CAUSATIVE AGENT OF AHPND Vibrio parahaemolyticus Hoàng Tùng1, Trịnh Thị Trúc Ly1, Nguyễn Giảng Thu Lan1, Nguyễn Hồng Phước2 Ngày nhận bài: 7/12/2017; Ngày phản biện thông qua: 22/12/2017; Ngày duyệt đăng: 29/12/2017 TÓM TẮT Vibrio parahaemolyticus là tác nhân gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) trên tôm he, gây thiệt hại nghiêm trọng cho nghề nuôi tôm của Việt Nam và thế giới trong những năm gần đây. Nghiên cứu này đánh giá khả năng kháng AHPND của tôm he Ấn Độ (Penaeus indicus) với đối chứng là tôm thẻ chân trắng Penaeus vannamei bằng thí nghiệm cảm nhiễm, sử dụng phương pháp ngâm với mật độ V. parahaemolyticus là 3×106 CFU/mL, theo dõi trong 144 giờ. Kết quả cho th ấy tỷ lệ chết tích lũy của P. indicus (9,2 ± 3,0 %) thấp hơn nhiều so với P. vannamei (96,7 ± 2,1 %) (P<0.01). Phát hiện này có thể được coi là xác nhận ban đầu về khả năng kháng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính của tôm he Ấn Độ. Các nghiên cứu tiếp theo về cơ chế kháng bệnh cũng như tỉ lệ kháng bệnh của quần đàn tôm tự nhiên là cần thiết hướng đến đa dạng hóa đối tượng nuôi, triển khai chương trình chọn giống kháng bệnh nhằm phát triển bền vững nghề nuôi tôm. Từ khóa: Penaeus indicus, AHPND, EMS, Vibrio parahaemolyticus, kháng bệnh ABSTRACT Vibrio parahaemolyticus is the causative agent of Acute Hepatopacreatic Necrosis Disease (AHPND) on penaeid shrimps. AHPND has caused tremendous losses to Vietnam and the global shrimp farming industry in recent years. This study evaluated resistance of Penaeus indicus juveniles to the causative agent of AHPND V. parahaemolyticus at 3×106 CFU/mL through a submerging challenge with P. vannamei was used as the control species. Observation on mortality was conducted for 144 hours. Results show that the accumulated mortality of P. indicus (9.2 ± 3%) was signifi cantly lower than that of P. vannamei (96.7 ± 2.1 %) (P<0.01). This preliminary fi nding is the fi rst-ever reported on resistance of P. indicus to AHPND. Future research should explore resistance mechanism and resistance level of different stocks of P. indicus to help implement selective breeding programs on this species, thus improving the sustainability of shrimp farming. Key words: Penaeus indicus, AHPND, EMS, Vibrio parahaemolyticus, resistance 1 Trường Đại học Quốc tế, Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh 2 Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II, Tp Hồ Chí Minh AHPND xuất hiện đầu tiên ở Trung Quốc năm 2009, rồi sau đó ở Việt Nam năm 2010, Thái Lan và Malaysia năm 2011 (Lightner 2012), Mexico và các quốc gia vùng Nam Mỹ trong giai đoạn 2013 - 2015 (Soto-Rodriguez et al. 2015; I. ĐẶT VẤN ĐỀ Trong những năm gần đây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease - AHPND) hay thường gọi là EMS đã gây thiệt hại lớn cho nghề nuôi he. Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2017 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 73 Han et al. 2015). Các đối tượng bị ảnh hưởng của AHPND bao gồm tôm sú Penaeus monodon, tôm thẻ chân trắng P. vannamei) và tôm nương P. chinensis (Flegel 2012). Bệnh thường xảy ra trong 20 ngày đầu của vụ nuôi và có thể gây chết đến 100% ở những ao bị nhiễm nặng. Tôm bị bệnh có đường tiêu hóa rỗng hoặc không đầy thức ăn, tuyến gan tụy bị sưng hoặc teo và có màu sắc bất thường, vỏ mềm, màu sắc nhợt nhạ (Lightner et al, 2012; Leano et al., 2012). Theo ước tính của Global Aquaculture Alliance (2013) thiệt hại do AHPND và các bệnh khác gây ra ở Châu Á tương đương với khoảng 1 tỉ USD mỗi năm. Tại Việt Nam bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng cả về sản lượng lẫn giá trị kinh tế (Zorriehzahra et al. 2015 ). Tác nhân gây AHPND đã được xác định là một chủng Vibrio parahaemolyticus đặc biệt (Tran et al. 2013) có mang pVA1 plasmid chứa gene sản sinh ra 2 loại protein PirAvp và PirBv, là độc tố phá hủy tuyến gan tụy của tôm bị bệnh (Lai et al. 2015). Tôm he Ấn độ Penaeus indicus là một trong những đối tượng nuôi phổ biến trên thế giới. Chúng phân bố tự nhiên ở khu vực Ấn Độ - Tây Thái Bình Dương và hiện đang được nuôi với qui mô nhỏ ở một số quốc gia như các Tiểu Vương Quốc Ả Rập, Việt Nam, Iran và Ấn Độ. Ở Việt Nam tôm he Ấn Độ thường được gọi là tôm thẻ đỏ đuôi. Tôm được nuôi chủ yếu theo hình thức quảng canh hoặc quảng canh cải tiến ở Kiên Giang và Cà Mau bằng nguồn tôm giống sản xuất tại địa phương (Hoàng Tùng, số liệu chưa công bố). Tốc độ tăng trưởng của tôm ở mức trung bình. Với thời gian nuôi từ 3 – 4 tháng, ở mật độ từ 5 – 10 con/m2, tôm có thể đạt cỡ 15 – 17 g. Theo một số nghiên cứu trước đây thì P. indicus có thể kháng được Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) gây bệnh trắng đuôi - white tail disease (Sudhakaran et al. 2006) và bệnh đốm trắng - white spot disease (Rajendran et al. 1999). Cho đến thời điểm hiện tại vẫn chưa có nghiên cứu nào đề cập đến khả năng kháng AHPND của P. indicus. Các quan sát ban đầu ở Việt Nam và các Tiểu Vương Quốc Ả Rập cho thấy P. indicus chưa có hiện tượng bị nhiễm AHPND (Cao Khánh Ly, trao đổi cá nhân). Qua nghiên cứu này, chúng tôi muốn đánh giá khả năng kháng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh EMS của P. indicus. Nghiên cứu này được kỳ vọng sẽ tạo tiền đề ban đầu cho các bước tiếp theo có liên quan đến công tác đa dạng hóa đối tượng nuôi hoặc triển khai chương trình chọn giống theo hướng kháng bệnh nhằm cải thiện tính bền vững của nghề nuôi tôm. II. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Vi khuẩn gây cảm nhiễm Tác nhân gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên tôm he Vibrio parahaemolyticus dùng cho thí nghiệm được Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản II thuộc Bộ Nông nghiệp & Phát triển Nông thôn phân lập và cung cấp. Độc lực của chủng này đã được kiểm tra lại trước khi bắt đầu thí nghiệm. Chủng V. parahaemolyticus gây bệnh được nuôi tăng sinh trong môi trường TSB (có bổ sung NaCl 1,5%) trong 24 giờ ở nhiệt độ 30oC. Mật độ vi khuẩn sau đó được xác định bằng máy so màu quang phổ (Thermal Scientifi c, UV-VIS 190_1100) ở bước sóng 600 nm kết hợp với phương pháp đếm số khuẩn lạc trên môi trường thạch TCBS (CFU/ ml) (Sanders 2012). Tiếp theo chúng tôi tiến hành pha loãng để có mật độ 3×106 CFU/ml phục vụ thí nghiệm cảm nhiễm. 2. Bố trí thí nghiệm cảm nhiễm Thí nghiệm cảm nhiễm được thực hiện tại PTN Công nghệ Sinh học Biển của Trường Đại học Quốc Tế - ĐHQG TPHCM với 4 nghiệm thức sử dụng 2 loài tôm là tôm he Ấn Độ P. indicus và tôm thẻ chân trắng P. vannamei (Bảng 1). Mỗi nghiệm thức được lặp lại 6 lần sử dụng tổng cộng 24 bể kính kích thước 60×40×50 cm chứa 30 lít nước biển 74 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2017 có độ mặn 30 ppm đã được xử lý bằng chlorine 30 ppm (Hi-Chlon 70, Nippon Soda Co. Ltd., Japan) và sục khí mạnh liên tục 72 giờ. Trước khi tiến hành thí nghiệm, các bể này đã được vệ sinh với chlorine 500 ppm và rửa sạch bằng nước ngọt. Bảng 1: Các nghiệm thức của thí nghiệm cảm nhiễm tác nhân gây AHPND Vibrio parahaemolyticus ở mật độ 3×106 CFU/mL Nghiệm thức Loài tôm sử dụng Cảm nhiễm Đối chứng (cI) Penaeus indicus không Đối chứng (cV) P. vannamei không Cảm nhiễm (iI) P. indicus có Cảm nhiễm (iV) P. vannamei có Tôm he Ấn Độ (P. indicus) sử dụng cho thí nghiệm được sản xuất tại Cà Mau từ 18 tôm mẹ thu thập ở địa phương. Tôm hậu ấu trùng 10 ngày tuổi PL10 sau đó được vận chuyển về Trường Đại học Quốc tế và tiếp tục ương trong bể 8-m3 thêm 70 ngày với mật độ 500 con/m3 ở độ mặn 30 ppt, nhiệt độ 27 – 31oC sử dụng thức ăn Mega (40% protein của Nutreco International Vietnam). Nước trong bể ương này được tuần hoàn liên tục (lưu lượng 1.200 lít/h) với bể 8-m3 thả nuôi cá rô phi (30 – 50 g/ con) ở mật độ 20 con/m3 nhằm ổn định chất lượng nước và duy trì mật độ tảo. Tôm thẻ chân trắng giai đoạn PL10 do Công ty Giống Thủy sản Nam Mỹ cung cấp được chuyển về từ Ninh Thuận và ương nuôi với qui trình tương tự. Từ hai đàn tôm này, chúng tôi chọn những cá thể có màu sắc tươi sáng, kích thước, khỏe mạnh, không bị tổn thương và không có dấu hiệu bệnh lý AHPND (tuyến gan tụy có màu sắc bình thường, không sưng hay teo, đường ruột đầy) để sử dụng cho thí nghiệm. Xét nghiệm PCR tiếp theo bằng phương pháp của Sirikharin et al. (2015) sử dụng bộ kit AccuLite AHPND Detection của Công ty Công nghệ Sinh học Khoa Thương cho thấy cả 2 đàn tôm này đều âm tính với AHPND. Mỗi bể thí nghiệm chứa 20 con tôm, có chiều dài thân 4.3 ± 0.4 cm. Sau 24 giờ làm quen với môi trường, tôm ở 2 nghiệm thức cảm nhiễm (iV và iI) được phơi nhiễm với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus ở mật độ 3×106 CFU/ml bằng phương pháp ngâm 60 phút. Sau 60 phút, nước biển đã xử lý được thêm vào bể cảm nhiễm, pha loãng mật độ vi khuẩn chỉ còn ½. Mức nước này được duy trì trong suốt thời gian thí nghiệm. Chúng tôi tiến hành quan sát tôm liên tục trong 144 giờ, ghi nhận các biểu hiện của tôm, thu mẫu ngay khi phát hiện tôm chết. Để có thể xét nghiệm AHPND bằng PCR khi kết thúc thời gian quan sát, mẫu tôm chết được bảo quản bằng cồn 70o . Đối với mẫu tôm dùng cho phân tích mô học, dung dịch cố định Davison được tiêm trực tiếp vào phần đầu ngực và phần bụng cho đến khi toàn bộ cơ ngấm đều với dung dịch cố định, màu sắc cơ thịt nhanh chóng chuyển sang màu hồng. Sau 48h, 70% dung dịch cố định được thay bằng ethanol để bảo quản đến khi phân tích. Thể tích cồn/Davison và mô tôm là 10:1. Tổng số mẫu tôm chết và sống thu từ mỗi nghiệm thức iV, iI, cV và cI lần lượt là 29, 10, 3 và 3 mẫu. Trong thời gian thí nghiệm, tôm được cho ăn 2 lần/ngày vào lúc 09:00 và 16:00 bằng thức ăn Mega (40% protein của Nutreco International Vietnam) với khẩu phần ăn tương đương với 3% khối lượng thân. Thức ăn thừa được siphon loại bỏ trước lần cho ăn tiếp theo. 3. Phương pháp xét nghiệm AHPND Tôm bị chết trong thí nghiệm được xét nghiệm AHPND bằng cả 2 phương pháp: PCR và mô học. Đầu tiên, chúng tôi tách chiết DNA từ các mẫu tôm bằng kit AccuLite AHPND Detection (EMS) của Công ty Công nghệ Sinh học Khoa Thương. Cặp mồi AP3-F (ATG-AGT- AAC-AAT-ATA-AAA-CAT-GAA-AC) & AP3-R Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2017 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 75 (GTG-GTA-ATA-GAT-TGT- ACA-GAA-3) được sử dụng để khuyếch đại đoạn gene gây độc (AHPND ToxA) có chiều dài 336 bps (Sirikharin et al. 2014). Chu trình nhiệt thực hiện phản ứng như sau: khởi đầu 94°C trong 5 phút; sau đó biến tính 94°C trong 30 giây; gắn mồi 53°C trong 30 giây; kéo dài 72°C trong 40 giây; lặp lại chu kì trên 35 lần; và bước kéo dài cuối cùng 72°C trong 5 phút. Dừng phản ứng và giữ mẫu ở 40C. Sản phẩm của phản ứng PCR được chạy điện di trên gel 1,5% trong dung dịch đệm SB 1x. Để xét nghiệm bằng phương pháp mô học, mẫu tôm chết được cố định được gửi phân tích tại Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II bằng phương pháp nhuộm Haematoxylin và Eosin, quan sát và chụp ảnh dưới kính hiển vi ở các vật kính 10X, 40X và 100X (Avwioro 2011). 4. Phương pháp xử lý số liệu Tỉ lệ chết tích lũy của tôm trong các nghiệm thức được so sánh bằng phân tích ANOVA một yếu tố ở mức ý nghĩa α = 0.05 bằng phần mềm SPSS (16.0 Student Version for Windows). Các giả định quan trọng của ANOVA về phân phối chuẩn và độ đồng nhất của phương sai được kiểm tra trước khi tiến hành kiểm định thống kê (Sokal & Rohlf 2009). Kết quả nghiên cứu được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± sai số chuẩn. III. KẾT QUẢ Tôm thẻ chân trắng P. vannamei trong nghiệm thức cảm nhiễm iV bắt đầu bỏ ăn sau vài giờ. Chúng chết nhiều trong 48 giờ đầu tiên, rải rác trong 24 giờ tiếp theo với tỉ lên chết tích lũy lên tới 90 – 100% trong các bể thí nghiệm. Tôm he Ấn Độ P. indicus bị cảm nhiễm Vibrio parahaemolyticus cũng chết đồng thời với tôm thẻ chân trắng, nhưng tỉ lệ chết thấp hơn rất nhiều. Tỉ lệ chết tích lũy của tôm không thay đổi trong 48 giờ cuối cùng của thí nghiệm. Tôm bị chết có các triệu chứng đặc trưng đã được mô tả cho bệnh hoại tử tuyến gan tụy cấp tính (AHPND) của Lightner et al. (2012) và Tran et al. (2013) như màu sắc cơ thể nhợt nhạt, bơi thất thường và chậm, tuyến gan tụy chuyển sang có màu trắng nhạt, ruột rỗng do tôm bỏ ăn. Tỷ lệ sống của tôm ở 2 nghiệm thức đối chứng (cV và cI) nằm ở mức cao, từ 95 – 98% cho thấy các điều kiện nuôi giữ phù hợp với yêu cầu của tôm. Số tôm này bắt mồi tích cực, di chuyển linh hoạt, có đường ruột đầy thức ăn và tuyến gan tụy với kích thước, màu sắc bình thường. Hình 1. Tỷ lệ chết tích lũy (%) của Penaeus indicus và P. vannamei trong thời gian thí nghiệm Hình 2. Kết quả khuếch đại gene gây bệnh hoại tử gan tụy cấp bằng cặp mồi đặc hiệu AP3 cho mẫu tôm chết. (I): Penaeus indicus; (V): Penaeus vannamei; (PC): đối chứng dương; (NC): đối chứng âm 76 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2017 Hình 3. Kết quả khuếch đại gene gây bệnh hoại tử gan tụy cấp bằng cặp mồi đặc hiệu AP3 cho mẫu tôm sống. (I): Penaeus indicus; (V): Penaeus vannamei; (PC): đối chứng dương; (NC): đối chứng âm Các mẫu tôm chết được xét nghiệm AHPND bằng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu cho chủng vi khuẩn gây bệnh. Toàn bộ mẫu xét nghiệm của tôm thẻ chân trắng (n = 18) đều cho kết quả dương tính, i.e. 1 vạch xuất hiện tại vị trí 336 bps (Hình 2a, b và c). Ngược lại, kết quả xét nghiệm PCR cho thấy 100% mẫu tôm he Ấn Độ chết thu được từ nghiệm thức iI (n = 4) và tôm sống thu từ các nghiệm thức của cả 2 loài khi kết thúc thí nghiệm (n = 11) đều âm tính với AHPND (Hình 2a & Hình 3). Phân tích tiêu bản mô học 11 mẫu tôm thẻ chân trắng bị cảm nhiễm trong nghiệm thức iV và đã chết cho kết quả dương tính với AHPND đến 91%. Các dấu hiệu bệnh lý như sự bong tróc của các tế bào biểu mô bên trong ống mô gan, vết tổn thương, sự xâm nhập của tế bào máu vào trong lòng ống gan tụy đều rất rõ ràng. Mức độ tổn thương được đánh giá ở cấp G4, là giai đoạn cuối của AHPND. Chỉ có 2/4 mẫu tôm he Ấn Độ chết ở nghiệm thức iI được xác định là vì AHPND bằng phương pháp mô học (Hình 4). Trong khi đó toàn bộ các các mẫu tôm sống của nghiệm thức này khi kết thúc thí nghiệm đều có tuyến gan tụy bình thường, phân biệt được các tế bào B (tế bào men tiêu hóa), R (tế bào dự trữ), E (tế bào chuyển tiếp) và F (tế bào phôi), hoàn toàn không có dấu hiệu nhiễm bệnh. Kết quả phân tích thống kê cho thấy tỉ lệ chết tích lũy của tôm thẻ chân trắng cao gấp 10,5 lần so với tôm he Ấn Độ khi cùng bị cảm nhiễm tác nhân gây AHPND là V. parahaemolyticus trong cùng một điều kiện và cao hơn khoảng 29 lần so với 2 nghiệm thức đối chứng (cV và cI) (P<0,01). Tỉ lệ chết của tôm he Ấn Độ bị cảm nhiễm tác nhân gây AHPND cao hơn 2 nghiệm thức đối chứng (P<0,01) khẳng định độc tính của chủng V. parahaemolyticus sử dụng trong thí nghiệm này. Điều lý thú là chỉ có khoảng 9% tôm he Ấn Độ bị chết vì cảm nhiễm. Đây là nghiên cứu đầu tiên cho thấy P. indicus có khả năng kháng tác nhân gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính, mở ra cơ hội tạo các dòng tôm he có sức đề kháng tốt hơn cho các vùng nuôi bị nhiễm AHPND của Việt Nam và khu vực châu Á. Hình 4. Tuyến gan tụy của tôm he Ấn Độ (Penaeus indicus) bị bệnh hoại tử gan tụy cấp tính AHPND A: Bong tróc; B: Tập trung các tế bào hồng cầu; C: Xuất hiện các trực khuẩn Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2017 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 77 Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) hiện là một trong những bệnh nguy hiểm nhất trên tôm nuôi. Tôm he Ấn Độ P. indicus mặc dù là đối tượng phụ nhưng vẫn có vai trò quan trọng trong cơ cấu sản lượng và là yếu tố tích cực xét về đa dạng hóa đối tượng nuôi. Trong khi AHPND gây hậu quả nghiêm trọng lên nghề nuôi tôm sú và tôm thẻ chân trắng thì vẫn chưa có ghi nhận nào được công bố về AHPND trên tôm he Ấn Độ. Nghiên cứu này của chúng tôi cho thấy P. indicus có khả năng kháng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus là tác nhân gây AHPND. Kết quả này tương đồng với các nghiên cứu trước đó về khả năng kháng các tác nhân gây bệnh đầu vàng, đuôi trắng và virus gan tụy của tôm he Ấn Độ P. indicus. Tần suất xuất hiện những bệnh này trên tôm he Ấn Độ rất thấp với tôm thẻ chân trắng P. vannamei hay tôm sú P. monodon (Chantanachookin et al. 1993; Senapin et al. 2010). Khả năng kháng bệnh của loài tôm he Ấn Độ còn được ghi nhận bởi Sudhakaran et al. (2006). Các tác giả đã chứng minh loài tôm này có khả năng kháng các tác nhân gây bệnh đuôi trắng là Nodavirus (MrNV) và extra small virus (XSV) do bởi quá trình cảm nhiễm không gây chết cho tôm thí nghiệm. Nghiên cứu của Linh (2017) trên tôm he Ấn Độ ở độ tuổi PL50 và kích thước nhỏ hơn (chiều dài thân 2,0 ± 0,2 cm) sử dụng cùng chủng Vibrio parahaemolyticus gây AHPND cho thấy tỉ lệ sống của tôm bị cảm nhiễm đạt 41%, chỉ bằng ½ so với kết quả của thí nghiệm này. Như vậy, khả năng kháng V. parahaemolyticus có thể được cải thiện ở tôm có tuổi hoặc kích cỡ lớn hơn. Đã có nghiên cứu cho thấy hệ vi sinh vật trong đường ruột có những ảnh hưởng nhất định đến vật chủ về mặt dinh dưỡng, đáp ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh. Chaiyapechara et al. (2011) sử dụng kỹ thuật 16S rDNA PCR-DGGE và giải trình tự cho thấy quần thể vi khuẩn đường ruột của tôm sú P. monodon thay đổi qua các giai đoạn phát triển của chúng. Hệ miễn dịch và tiêu hóa của tôm nhỏ chưa được phát triển một cách toàn diện. Do đó tôm dễ bị ảnh hưởng và mắc các bệnh do vi khuẩn. Jiravanichpaisal et al. (2007) cũng đã cho biết biểu hiện của peptide kháng khuẩn penaedin của tôm ở giai đoạn hậu ấu trùng thấp hơn so với giai đoạn ấu niên. Nghiên cứu này của chúng tôi cho thấy tôm he Ấn Độ kháng V. parahaemolyticus gây AHPND tốt hơn so với tôm thẻ chân trắng. Tỉ lệ chết của tôm thẻ chân trắng bị phơi nhiễm lên đến 97% chỉ sau 96 giờ. Thực tế cũng chứng minh tôm thẻ chân trắng là loài có khả năng kháng bệnh thấp và không ổn định, dễ nhiễm các bệnh nguy hiểm thường gặp do vi khuẩn/ virus như hội chứng chết sớm (EMS), bệnh đỏ thân (TVS), đốm trắng (WSSV) và phân trắng với tỷ lệ chết rất cao, dao động từ 50-100% (Đặng Thị Đoan Trang, 2015). Kết quả này tương đồng với thí nghiệm đánh giá khả năng kháng bệnh hoại tử gan tụy cấp của các chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus khác nhau trên tôm thẻ chân trắng do Soto-Rodriguez và cộng sự thực hiện (2015), với tỷ lệ tôm chết tích lũy dao động từ 80 - 90% chỉ trong 24 giờ đầu tiên, khá phù hợp với thực tế ở các ao nuôi tôm thẻ chân trắng bị nhiễm AHPND với tỷ lệ chết lên đến 100% chỉ sau vài ngày nhiễm bệnh (Tran et al. 2013). Hiện nay cơ chế kháng tác nhân gây AHPND ở tôm he vẫn chưa được xác định rõ ràng. Theo một số nghiên cứu trước đây, khả năng kháng bệnh ở một số loài động vật có xương sống có liên quan đến việc sản xuất ra các hợp chất kháng thể bactericidin, lysin và agglutinin sau khi tiếp xúc với các protein ngoại lai (Bang 1967; Mckay & Jenkin 1969). Về mặt di truyền Gitterle et al. (2005) cho biết một số dòng tôm thẻ chân trắng có thể kháng virus gây bệnh đốm trắng (WSSV). Trong thực tế, Argue et al. (2002) đã chọn được dòng tôm thẻ chân trắng có khả năng kháng virus gây hội chứng Taura (TSV) với tỷ lệ sống sau khi cảm nhiễm lên đến 90%, cao hơn 18,4% so với tôm đối chứng. Kết quả ban đầu của chúng tôi cho thấy cần tập trung nghiên cứu về đặc điểm 78 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2017 di truyền trong mối liên quan với khả năng kháng AHPND của tôm he Ấn Độ để có thể tạo dòng tôm kháng AHPND hiệu quả, phục vụ nghề nuôi tôm trong nước và khu vực. IV. KẾT LUẬN Tôm he Ấn Độ Penaeus indicus giai đoạn ấu niên (PL80) nguồn gốc từ khu vực Cà Mau – Kiên Giang có khả năng kháng Vibrio parahaemolyticus là tác nhân gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính AHPND. Kết quả này tạo tiền đề cơ bản cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm phát triển nghề nuôi tôm he Ấn Độ, giúp giảm thiểu rủi ro về dịch bệnh trong quá trình nuôi cho người sản xuất. LỜI CẢM ƠN Nghiên cứu này là một phần của đề tài 106-NN.05-2015.70 do Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) tài trợ. Chúng tôi xin chân thành cảm ơn NAFOSTED, Trường Đại học Quốc tế - ĐHQG TPHCM, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II, bà Nguyễn Thị Thủy (Trường Đại học Đồng Tháp), ông Phan Thanh Sơn (Hợp tác Đồng Khởi, Cà Mau), ông Nguyễn Dũng (Trại tôm giống Nguyễn Dũng, Năm Căn), ông Bùi Văn Chẩm (Công ty Giống Thủy sản Nam Mỹ), ông Vũ Hồng Hiếu (Công ty Mekong EcoShrimp) và bà Hồ Hải Cơ (Khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Quốc tế) đã nhiệt tình giúp đỡ trong quá trình thực hiện nghiên cứu. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Đặng Thị Đoan Trang, Lê Thành Cường, Phạm Quốc Hùng (2015). Một số bệnh nguy hiểm thường gặp trên tôm chân trắng (Litopenaeus vannamei) nuôi thương phẩm tại tỉnh ninh thuận. Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản, số 3/2015. Tiếng Anh 2. Argue B.J., Arce S.M., Lotz J.M., Moss S.M. (2002) Selective Breeding of Pacifi c White Shrimp (Litopenaeus vannamei) for Growth and Resistance to Taura Syndrome Virus. Aquaculture 204: 447-460. 3. Avwioro G. (2011) Histochemical uses of haematoxylin – a review. JPCS 1: 24-34. 4. Bang F.B. (1967) Serological responses among invertebrates other than insects. Fed. Proc. 267: 1680–1684. 5. Chaiyapechara S., Rungrassamee W., Suriyachay I., Kuncharin Y., Klanchui A. (2011) Bacterial Community Associated with the Intestinal Tract of P. monodon in Commercial Farms. Microb Ecol. 6. Chantanachookin C., Boonyaratpalin S., Kasornchandra J., Direkbusarakom S., Ekpanithanpong U., Supamataya K., Sriurairatana S., Flegel T.W.(1993). Histology and ultrastructure reveal a new granulosis-like virus in Penaeus rnonodon affected by yellow-head virus. Dis. Aquat. Org 17:145–157. 7. Lightner D.V., Redman R.M., Pantoja C.R., Noble B.L., Tran L. (2012) Early Mortality Syndrome affects shrimp in Asia. Glob. Aquacult. Advocate 8. Flegel T.W. (2012) Historic emergence, impact and current status of shrimp pathogens in Asia. J. Invertebr. Pathol. 110: 166-173. 9. Gitterle T., Salte R., Gjerde B., Cock J., Johansen H., Salazar M., Lozano C., Rye M. (2005) Genetic (co) variation in resistance to White Spot Syndrome Virus (WSSV) and harvest weight in Penaeus (Litopenaeus) vannamei. Aquaculture 246: 139 – 149. 10. Han J.E., Tang K.F.J., Lightner D.V. (2015) Genotyping of the virulence plasmid harbored in the Vibrio parahaemolyticus isolates causing acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) in shrimp. Dis. Aquat. Organ. 115: 245–251 Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 4/2017 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • 79 11. Jiravanichpaisal P., Puanglarp N., Petkon S., Donnuea S., Söderhäll I. (2007) Expression of immune-related genes in larval stages of the giant tiger shrimp, Penaeus monodon. Fish & Shellfi sh Immunology 23: 815–824. 12. Lai H.C., Tze H.N., Ando M., Lee C.T., Chen I.T, Chuang J.C., Mavichak R., Chang S.H., Yeh M.D., Chiang Y.A., Takeyama H., Hamaguchi H., Lo C.F., Aoki T., Wang H.C. (2015) Pathogenesis of acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) in shrimp. Fish & Shellfi sh Immunology 47: 1006-1014. 13. Leano E.M., Mohan C.V. (2012) Early mortality syndrome threatens Asia’s shrimp farms. Global Aquaculture Advocate July/Aug: 38–39. 14. Linh G. Tran (2017) Evaluation of resistance to the acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) in Penaeus indicus PL 50-55 . BSc thesis, International University – Vietnam National University HCMC, Vietnam. 15. Mckay D., Jenkin C.R. (1969) Immunity in invertebrates: II. Adaptive immunity in the cray fi sh Parachaeraps bicarinatu. Immunology 17: 127–137. 16. Rajendran K.V., Vijayan K.K., Santiago T.C., Krol R.M. (1999) Experimental host range and histopathology of white spot Syndrome virus (WSSV) infection in shrimp, prawns, crabs and lobsters from India. Journal of Fish Diseases 22: 183-191. 17. Ribeiro F (2010) Development morphology and oncogeny of penaeid prawns postlarva; Alday-Sanz V, editor. Nottingham, UK: Nottingham University Press. 18. Senapin S., Thaowbut Y., Gangnonngiw W., Chuchird N., Sriurairatana S., Flegel T.W. (2010) Impact of yellow head virus outbreaks in the whiteleg shrimp, Penaeus vannamei (Boone), in Thailand. Journal of Fish Diseases 33: 421–430. 19. Sirikharin R., Taengchaiyaphum S., Sritunyalucksana K., Thitamadee S., Flegel T.W., Mavichak R., Proespraiwong P. (2014) A new and improved PCR method for detection of AHPND bacteria. Network of Aquaculture Centres in Asia-Pacifi c (NACA). 20. Soto-Rodriguez S.A., Gomez-Gill B., Lozano-Olvera R., Betancourt-Lozano M., MoralesCoarrubias M.S. (2015). Field and experimental evidence of Vibrio parahaemolyticus as the causative agent of acute hepatopancreatic necrosis disease of cultured shrimp (Litopenaeus vannamei) in Northwestern Mexico. Appl. Environ. Micro. 81: 1689– 1699. 21. Sanders E.R. (2012). Aseptic laboratory techniques: plating methods. Journal of Visualized Experiments 63: 1-18. 22. Sudhakaran R., Musthaq S.S., Haribabu P. (2006) Experimental transmission of Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) and extra small virus (XSV) in three species of marine shrimp (Penaeus indicus, Penaeus japonicas and Penaeus monodon). Aquaculture 257:136–141. 23. Tran L., Nunan L., Redman R.M., Mohney L.L., Pantoja C.R., Lightner D.V. (2013) Determination of the infectious nature of the agent of acute hepatopancreatic necrosis syndrome affecting penaeid shrimp. Dis. Aquat. Organ. 105, 45–55. 24. Zorriehzahra M.J., Banaederakhshan R. (2015) Early mortality syndrome (EMS) as new emerging threat in shrimp industry. Adv. Anim. Vet. Sci. 3(2): 64-72.