Giáo trình Thực hành Hóa sinh học

Thực hành Hóa Sinh Học – Khoa Công nghệ ThS. Cao Ngọc Minh Trang 1 NHỮNG ĐIỂM CẦN CHÚ Ý TRONG THỰC HÀNH HÓA SINH I. Đối với sinh viên thực tập - Mỗi nhóm thực tập phải chịu trách nhiệm về: trật tự, an toàn, dụng cụ, hóa chất và kết quả thí nghiệm cho bài tập thực tập của mình. - Sinh viên phải có mặt trong phòng thí nghiệm đúng giờ qui định, phải có mặt tại phòng thí nghiệm suốt thời gian thực tập. Sinh viên đến trễ 15 phút không được vào phòng thí nghiệm. Khi kết thúc thí nghiệm sinh viên phải báo cáo kết quả với giáo viên hướng dẫn trước lúc ra về. - Sinh viên vắng mặt phải có giấy phép và phải xin thực tập bù bữa khác. - Sinh viên phải xem kỹ bài thực tập trước khi vào phòng thí nghiệm. - Mỗi nhóm thực tập cử một sinh viên đại diện ký nhận mượn dụng cụ: kiểm tra tình hình dụng cụ (thiếu, hỏng, vỡ) báo cáo ngay cho giáo viên hướng dẫn. Sinh viên phải rửa dụng cụ sạch sẽ trước và sau khi thực tập. Kết thúc buổi thực tập mỗi nhóm phải lau dọn, làm sạch chỗ nhóm mình làm thí nghiệm, nếu dụng cụ bị mất mát, hư hỏng phải báo ngay cho phụ trách phòng thí nghiệm biết. - Mỗi buổi thực tập, nhóm trực nhật có nhiệm vụ: nhắc nhở các nhóm dọn vệ sinh, kiểm tra điện, nước và cửa trước khi ra về. - Mỗi nhóm sinh viên làm bài báo cáo kết quả theo yêu cầu của từng bài thực tập, nộp kết quả cho giáo viên hướng dẫn vào cuối buổi thực tập hoặc buổi kế tiếp. - Kết thúc mỗi bài thực tập có kiểm tra kết quả và đánh giá cho điểm. II. Đối với phòng thí nghiệm 1. Cẩn thận khi tiến hành thí nghiệm, không được sử dụng những máy móc, dụng cụ khi chưa biết rõ cách sử dụng. Phải hiểu biết rõ tính chất của các hóa chất để tránh tai nạn đáng tiếc. 2. Tất cả chai lọ đựng hóa chất đều có nhãn, khi dùng phải đọc kỹ tên và nồng độ, dùng xong phải đậy đúng nút và để lại đúng chỗ cũ. Phần lớn các hóa chất là độc nên phải hết sức cẩn thận. 3. Đối với các chất kiềm, acid đậm đặc phải lưu ý: - Không được hút bằng miệng. - Phải dùng ống đong hoặc bình nhỏ giọt. Thực hành Hóa Sinh Học – Khoa Công nghệ ThS. Cao Ngọc Minh Trang 2 - Phải đổ acid hoặc kiềm vào nước khi cần pha loãng chúng. - Phải đặt nghiêng miệng ống nghiệm hoặc cốc về phía không có người. - Khi acid bị đổ ra ngoài thì cho nhiều nước để làm loãng acid 4. Khi theo dõi dung dịch đang sôi không được đưa mặt gần hay khi để một chất lỏng (chất kiềm) vào cốc phải đưa ra xa. Khi đun một chất lỏng trong ống nghiệm hay cho acid, kiềm vào phải đặt ống nghiệm nghiêng một góc 45 độ. Khi đung phải lắc đều và hướng miệng ống nghiệm về phía không có người. 5. Khi làm việc với chất dễ cháy: Khi sử dụng các chất dễ cháy như ether, xăng, benzene, chloroform, natri, kali cần lưu chú ý: - Không dùng lửa ngọn và tránh xa lửa ngọn. - Không để chất dễ cháy bên cạnh nguồn sinh nhiệt (chất dễ cháy, dễ bốc hơi có thể làm nổ máy hay bật nút, hơi bốc ra gặp ngọn lửa sẽ cháy, cả khi ngọn lửa ở xa). - Khi chữa cháy phải bình tĩnh dập tắt ngọn lửa bằng khăn ướt hay bình chữa cháy. 6. Khi làm việc với dụng cụ thủy tinh: - Kiểm tra dụng cụ kỹ trước khi dùng. - Tránh đổ vỡ. - Dụng cụ nào dùng cho việc đó. Khi đun, chỉ được đun bằng dụng cụ thủy tinh chịu nhiệt. - Dụng cụ phải được rửa sạch trước và sau khi sử dụng. - Không dùng dụng cụ thủy tinh, chai lọ để chứa các chất kiềm mạnh hoặc acid đậm đặc có tác dụng bề mặt ăn mòn thủy tinh như HF. 7. Khi làm việc với dụng cụ điện hoặc sử dụng điện tay phải khô, chỗ làm việc phải khô. Kiểm tra kỹ nguồn điện và dây dẫn điện khi sử dụng. III. An toàn ở phòng thí nghiệm hóa sinh Những tai nạn có thể xảy ra trong các phòng thí nghiệm nói chung và labo hóa sinh nói riêng bao gồm: - Nhiễm khuẩn, ký sinh trùng và virus từ các mẫu bệnh phẩm. - Tai nạn gây ra do hóa chất độc hóa học, các chất ăn mòn, thủy tinh bị gẫy hay bị điện giật. Thực hành Hóa Sinh Học – Khoa Công nghệ ThS. Cao Ngọc Minh Trang 3 - Cháy hoặc nổ do các hóa chất hay dung môi dễ cháy, dễ nổ. - Để đảm bảo an toàn, hạn chế những tai nạn trong khi làm việc tại phòng thí nghiệm cần phải chú ý những điểm sau đây: 1. Tránh bị nhiễm khuẩn Đối với cá nhân: - Rửa tay bằng xà phòng sau khi làm thí nghiệm. - Mặc áo choàng trong phòng thí nghiệm. - Không ăn uống, hút thuốc lá trong phòng thí nghiệm. Không để bất kỳ thức ăn hay đồ uống trong tủ lạnh của phòng thí nghiệm. Đối với các mẫu bệnh phẩm: Các bệnh phẩm là những mẫu xét nghiệm lấy từ bệnh nhân thường có thể gây nhiễm khuẩn, virus viêm gan, ký sinh trùng Vì vậy: - Không hút trực tiếp bệnh phẩm bằng pipet, dùng pipet có lắp quả bóp bằng cao su. - Nếu ống ly tâm đựng bệnh phẩm bị vỡ trong khi ly tâm, phải dùng kẹp để gắp các mảnh vỡ ra. - Khử trùng các dụng cụ bị nhiễm khuẩn sau khi làm xét nghiệm theo qui định ở phần rửa dụng cụ. 2. An toàn khi sử dụng hóa chất và thuốc thử Đối với các chất dễ cháy như dung môi (ete, toluene, methanol, ethanol, aceton) và một số hóa chất khác có ghi biểu tượng tránh lửa trên nhãn: - Trước khi mở nút phải tránh xa ngọn lửa trần từ 2 – 3 m. - Không đun trực tiếp trên ngọn lửa, phải đun cách thủy hoặc trên bếp điện kín. - Đối với chất ăn mòn như các acid (H2SO4, HNO3, CCl3COOH, H3PO4 ) và kiềm (NaOH, KOH): - Không được hút trực tiếp bằng mồm, phải dùng pipet tự động hoặc có lắp quả bóng cao su. - Khi đổ các dung dịch vào chai hay ống nghiệm phải từ từ, thận trọng, làm dưới tầm mắt để tránh dung dịch bị bắn vào mắt. - Khi hòa tan các chất ăn mòn thể đặc vào nước. Ví dụ: hòa NaOH vào nước hay hòa loãng acid đặc vào nước cần phải tiến hành hết sức thận trọng vì đó là phản ứng tỏa nhiệt. Đặc biệt cần chú ý khi hòa loãng acid, phải đổ acid vào nước, đổ từ từ, tuyệt Thực hành Hóa Sinh Học – Khoa Công nghệ ThS. Cao Ngọc Minh Trang 4 đối không đổ nước vào acid, vì chỉ cần đổ 1 lượng nhỏ nước vào acid có thể gây vỡ bình thủy tinh. Đối với các chất độc là những chất có thể gây chết người hoặc gây bệnh nặng nếu ngửi hay nuốt phải hoặc dính vào da. Ví dụ những chất độc phổ biến trong phòng thí nghiệm như: kali cyanua, nitrat thủy ngân II, natri azid, natrinitropusiat, thiosemicarbazid, chloroform, methanol, acid clohydric: - Cần hết sức thận trọng khi thao tác với các chất độc. - Những chất độc phải được cất ngay vào tủ khóa sau khi sử dụng. Không để tự do trên bàn thí nghiệm hay trên đĩa cân. Những chất oxy hóa (chlorat, pechlorat, peroxyd mạnh, kali dichromat, acid chromic) cũng phải thao tác hết sức cẩn thận vì chúng cũng gây nguy hiểm cho da và mắt. Những hóa chất gây ung thư: là những chất có khả năng gây ung thư nếu hít hay nuốt phải, hoặc dính vào da. Ví dụ: benzen, benzidin, o-toludin (khác với o – tuluidin), α- và β-naphtylamin, nitrosamin, nitrosophenyl Khả năng gây ung thư của các chất trên tỷ lệ với thời gian tiếp xúc và nồng độ hóa chất gây ung thư. Vì vậy phải hết sức cẩn thận, nên dùng găng tay và khẩu trang khi tiếp xúc với chúng. IV. Các biện pháp sơ cấp cứu tại phòng thí nghiệm Sơ cấp cứu là biện pháp tạm thời đối với các trường hợp thương tích nhẹ hoặc trước khi đưa bệnh nhân đến bệnh viện như: 1. Bỏng a. Bỏng do nhiệt (hay vật nóng) - Bỏng nhẹ: Lấy vải gạc y tế tẩm dung dịch acid picric bão hòa đắp lên mặt vết bỏng. - Bỏng nặng: Đắp nhẹ vải gạc y tế tẩm dung dịch acid picric lên vết bỏng, sau đó chuyển đi bệnh viện. b. Bỏng do hóa chất Việc trước tiên là ngâm vết thương vào chậu nước to hoặc để vết thương dưới vòi nước chảy thật nhẹ. Sau đó mới trung hòa hóa chất. Chú ý các trường hợp sau: - Bỏng do acid: Đắp vải gạc y tế tẩm dung dịch bicarbonate natri 8%. - Bỏng do kiềm: Đắp vải gạc y tế tẩm dung dịch acid picric 3%. Thực hành Hóa Sinh Học – Khoa Công nghệ ThS. Cao Ngọc Minh Trang 5 2. Tai nạn về mắt - Acid hay brom vào mắt: Rửa mắt tức khắc nhiều lần bằng nước sạch, sau đó tẩm mắt trong dung dịch bicarbonat natri 1%. - Chất kiềm vào mắt: Xử lý trên rồi tẩm mắt bằng dung dịch acid boric 1%. 3. Ngộ độc Khi bị chất độc vào miệng: - Acid: Xúc miệng nhiều lần bằng dung dịch bicarbonate natri 1%. - Kiềm: Xúc miệng nhiều lần bằng dung dịch acid 1%. - Các hóa chất khác: Xúc miệng nhiều lần bằng nước lạnh. 4. Nhiễm hơi độc Đưa nạn nhân ra nơi thoáng khí, nới rộng quần áo cho dễ thở. Hô hấp nhân tạo trong lúc di chuyển đến bệnh viện. 5. Điện giật Trước hết ngắt mọi cầu dao điện có liên quan đến phòng thí nghiệm. Nới rộng quần áo nạn nhân sau khi đem ra nơi thoáng. Hô hấp nhân tạo trong khi chờ chuyển đến bệnh viện nếu là trường hợp nặng. 6. Hỏa hoạn - Ngọn lửa nhỏ: dập tắt bằng khan, vải bố ướt hay cát. - Lửa bắt đầu cháy quần áo: lăn vài vòng dưới đất để dập tắt ngọn lửa, trong khi các bạn lấy vải ướt trùm lên chỗ cháy và ép sát cho đến khi lửa tắt. Tránh chạy hoảng. - Dùng bình chửa cháy trước phòng thí nghiệm để dập lửa. Lưu ý: Sinh viên phải báo ngay cho nhân viên phòng thí nghiệm hoặc giáo viên hướng dẫn về mọi sự cố trong phòng thí nghiệm. 7. Xử lý chất thải - Hóa chất thừa: Phần lớn các thuốc thử, hóa chất thừa được đổ từng ít một vào bể rửa rồi xả nước. Một số hóa chất kiềm và acid phải được trung hòa trước khi đổ vào bể rửa. - Bệnh phẩm thừa: Những bệnh phẩm đã dùng để làm xét nghiệm như máu, nước tiểu, dịch não tủy thường là những chất truyền nhiễm. Sau khi làm xét nghiệm, các mẫu bệnh phẩm thừa còn lại phải được hủy đi cẩn thận để tránh lây lan. Phương pháp Thực hành Hóa Sinh Học – Khoa Công nghệ ThS. Cao Ngọc Minh Trang 6 đơn giản và bảo đảm nhất là chôn hoặc đốt thành tro (kể cả những dụng cụ đựng không cần thu hồi). - Hóa chất và bệnh phẩm nguy hiểm: như những hoá chất độc có khả năng gây ung thư, gây nổ cần được chứa vào bình chuyên dụng và được xử lý theo phương thức riêng. CÁC DỤNG CỤ THƯỜNG DÙNG TRONG THỰC TẬP HÓA SINH Cách rửa các dụng cụ: • Cần phải biết tính chất của những chất làm bẩn dụng cụ để có thể chọn phương pháp rửa trong từng trường hợp riêng (trong nước nóng hay nước lạnh, trong dd kiềm, trong các muối hay acid hoặc trong các dung môi hữu cơ). • Các dụng cụ sau khi rửa sạch được ngâm vào dd sulfocromic là hỗn hợp của K2Cr2O7 10% và acid sulfuric đđ cùng một thể tích trong 1 ngày. Sau đó, đem rửa sạch với nước máy và tráng một lần với nước cất, xong sấy khô trong tủ sấy dụng cụ. Ống nghiệm (tube) • Có thể tích khác nhau, hình trụ ( Ø = 16, 18,). • Lưu ý khi đun nóng 1 dd trong ống nghiệm: dd không được đầy quá 1/3 ống nghiệm và ống được giữ nghiêng 450, luôn lắc đều. Không được đun nóng ngay tại đáy ống nghiệm mà ngọn lửa phải được để vào thành của ống nghiệm Ống hút (pipette) • Loại có vòng mờ trên đầu ống: dung tích của ống gồm cả giọt cuối cùng dính trong ống nên phải thổi giọt này ra. • Loại có bầu an toàn: dùng để hút những dd độc • Loại có hai vạch: thể tích ghi trên ống là thể tích giữa 2 vạch • Loại thông thường có chia độ Ống chuẩn đô ( burette) • Được gắn trên giá và có khóa để điều chỉnh lượng chất lỏng chảy ra trên ống có phân độ. Thực hành Hóa Sinh Học – Khoa Công nghệ ThS. Cao Ngọc Minh Trang 7 Ống đong (eprouvette) • Có dung tích thay đổi từ 5ml đến 2l, có thể có mặt đáy và được phân độ chỉ gần đúng nhưng thể tích toàn phần vẫn đúng. • Không dùng ống đong để chia những lượng quá nhỏ. Bình nón ( erlenmeyer) • Được sử dụng rộng rãi trong các thí nghiệm phân tích • Bình nón có nút mài được gọi là bình xác định chỉ số iode Phễu chiết hay bình lóng • Dùng để tách riêng các chất lỏng không hòa tan vào nhau • Khi lắc bình lóng tay phải giữ nút ở đầu trên và đầu dưới bình Bình hút ẩm • Là dụng cụ thủy tinh có thành dày và có nắp dùng để làm khô từ từ và để bảo quản những chất dễ hút hơi ẩm từ không khí. Phần dưới của bình có đặt những chất hút ẩm • Khi mở nắp bình phải đẩy nắp về một phía và tránh nhấc nắp lên cao Ống sinh hàn • Là dụng cụ để làm lạnh và ngưng hơi • Khi nối ống sinh hàn cần tuân theo nguyên tắc: nước đi vào từ đầu thấp bên dưới và đi ra từ đầu phía trên. Bình định mức (fiole jaugé) • Dùng để pha loãng một dd bất kỳ đến một thể tích xác định hoặc để hòa tan một chất nào đó trong một thể tích xác định dung môi thích hợp Chén nung (creuset) • Dùng để nung các chất khác nhau, để đốt các hợp chất hữu cơ khi xác định hàm lượng tro • Có thể đốt trực tiếp trên ngọn lửa mà không cần lưới amian Thực hành Hóa Sinh Học – Khoa Công nghệ ThS. Cao Ngọc Minh Trang 8 Chương I: PROTEIN Bài 1: PHẢN ỨNG BIURET XÁC ĐỊNH LIÊN KẾT PEPTID Trong môi trường kiềm, các liên kết peptide trong protein có thể phản ứng với Cu2+ tạo thành phức chất màu xanh tím, tím, tím đỏ hay đỏ ở dưới dạng anion. Cường độ màu thay đổi tùy thuộc vào độ dài mạch peptide. Một số hợp chất có hai nhóm amid như Biuret, oxamid cũng cho phản ứng Biuret dương tính. Phản ứng biure thường được ứng dụng để định lượng protein do có màu bền vững và ổn định. Nguyên liệu và hóa chất: - Dung dịch protein trứng khoảng 1% (Pha loãng 1 lòng trắng trứng với 15 thể tích nước cất, lọc qua vài lần vải gạc, bảo quản ở 4oC. Khi dùng pha loãng 0,1%). - Dung dịch gelatin 0,1% trong nước. - Dung dịch glycin 0,1% trong nước. - Dung dịch CuSO4 1% trong nước. - Dung dịch NaOH 10% trong nước. Dụng cụ: - Ống nghiệm, giá ống nghiệm, cặp ống nghiệm - Pipet Pasteur Cách tiến hành: Cho vào 3 ống nghiệm đánh số: 1 2 3 Dung dịch protein trứng 0,1% (giọt) Dung dịch gelatin 0,1% trong nước (giọt) Dung dịch glycin 0,1% trong nước (giọt) Dung dịch NaOH 10% trong nước (giọt) Dung dịch CuSO4 1% trong nước (giọt) 5 3 1 5 3 1 5 3 1 Nhận xét màu sắc, giải thích các thí nghiệm. Thực hành Hóa Sinh Học – Khoa Công nghệ ThS. Cao Ngọc Minh Trang 9 Bài 2: BIẾN TÍNH PROTEIN Sự biến tính của protein được ứng dụng trong các xét nghiệm lâm sàng, trong kiểm nghiệm thuốc và thực nghiệm hóa sinh như: - Kết tủa protein trong các nguyên liệu sinh vật để tiếp tục nghiên cứu cấu trúc và tính chất sinh học của chúng. - Định tính và định lượng protein trong các dịch chiết và dịch sinh vật (đặc biệt là phản ứng xác định protein niệu để thăm dò chức năng thận). - Giải độc muối kim loại nặng (Hg, Cu, Pb) bằng protein (trứng, sữa) trong trường hợp cơ thể chưa kịp hấp thu hoặc có thể sử dụng trong phòng bệnh cho những người phải tiếp xúc với các hóa chất này. Thông thường sự biến tính của protein là không thuận nghịch, nhưng trong một số trường hợp nếu loại bỏ được tác nhân gây biến tính thì protein vẫn giữ được cấu dạng và tính chất ban đầu của nó. Thuốc thử và vật liệu thí nghiệm: - Dung dịch protein trứng không có NaCl (Lọc lòng trắng trứng gà qua vải thưa. Trộn lẫn một thể tích lòng trắng với 15 thể tích nước cất. Trộn kỹ rồi lọc lại sẽ thu được dung dịch protein trứng khoảng 1%. Bảo quản ở 4oC). - Dung dịch acid acetic 1% và 10%. - Dung dịch NaOH 10%. - Dung dịch NaCl bão hòa - Acid nitric đặc - Dung dịch acid trichloracetic 10% - Dung dịch acid sulfosalicylic 20% - Dung dịch CuSO4 5% trong nước - Dung dịch Pb(CH3COO)2 5% trong nước - Ethanol 96o - Aceton Dụng cụ: - Ống nghiệm nhỏ - Pipet 5 hoặc 10mL Thực hành Hóa Sinh Học – Khoa Công nghệ ThS. Cao Ngọc Minh Trang 10 - Pipet Pasteur - Quả bóp cao su 1 – 2 mL - Phễu nhỏ - Giấy lọc 2.1. Biến tính protein bằng nhiệt độ Protein bị kết tủa khi đun sôi trong môi trường trung tính hay acid yếu vì bị mất lớp áo nước và vì phần lớn protein có pI  5 (trừ protamin và histon có chứa nhiều acid amin kiềm nên có pI  8), nếu cho thêm chất điện giải cũng làm trung hòa điện tích gây tủa protein dễ dàng hơn. Tiến hành: Dùng 5 ống nghiệm ghi số: Thuốc thử 1 2 3 4 5 Protein trứng không có NaCl (mL) CH3COOH 1% (giọt) CH3COOH 10 % (giọt) Dung dịch NaCl bão hòa (giọt) Dung dịch NaOH 10% (giọt) 1 1 2 1 5 1 5 4 1 4 Đun sôi ống nghiệm và nhận xét sự kết tủa. 2.2. Biến tính protein bằng acid vô cơ mạnh Dưới tác dụng của acid vô cơ đậm đặc, protein bị kết tủa. Tủa sẽ hòa tan trở lại khi cho thừa acid, trừ acid nitric. Vì vậy HNO3 được sử dụng để định tính protein trong nước tiểu. Tiến hành: Tủa protein bằng HNO3 và H2SO4. Thực hành Hóa Sinh Học – Khoa Công nghệ ThS. Cao Ngọc Minh Trang 11 Dùng 2 ống nghiệm: Thuốc thử 1 2 Dung dịch protein 0,1% (giọt) 5 5 HNO3 đặc (giọt) nhỏ từ từ vào thành ống để nghiêng 5 H2SO4 đặc (giọt) nhỏ từ từ vào thành ống để nghiêng 5 Xuất hiện tủa trắng của protein ở mặt ngăn cách giữa hai lớp chất lỏng. Sau đó lắc nhẹ ống nghiệm. Thêm 5 giọt acid mỗi loại vào 2 ống tương ứng. Nhận xét kết quả ở 2 ống nghiệm. 2.3. Biến tính protein bằng acid hữu cơ: Phản ứng kết tủa protein bằng acid hữu cơ xảy ra không thuận nghịch. Trong labo hóa sinh thường dùng: - Acid tricloracetic (CCl3COOH) để kết tủa protein nhưng không kết tủa peptid và acid amin nên được dùng để khử tạp protein ra khỏi huyết thanh trong các xét nghiệm định lượng các chất phi protid như ure, acid amin, acid uric, sau đó muốn loại bỏ nó ra khỏi dịch lọc chỉ cần đun sôi vì acid này sẽ bị hủy thành CHCl3 và CO2. - Acid sulfosalicylic [C6H3(OH)(COOH)SO3H] được dùng để phát hiện protein trong nước tiểu và các dung dich sinh học khác. Tiến hành: Cho vào 1 ống nghiệm: - Dung dịch protein 0,1 %: .. 5 giọt - Dung dịch acid trichloracetic: 2 giọt Nhận xét kết quả. Thực hành Hóa Sinh Học – Khoa Công nghệ ThS. Cao Ngọc Minh Trang 12 2.4. Biến tính protein bằng muối kim loại nặng Ion kim loại nặng có khả năng gắn vào các nhóm chức ở mạch nhánh của acid amin trong phân tử protein làm phá vỡ cấu trúc không gian và gây tủa. Nếu cho thừa muối kim loại nặng (trừ AgNO3 và HgCl2), tủa sẽ tan vỡ lại do hấp thụ các ion kim loại tạo điện tích dương trên phân tử protein. Tiến hành Cho vào hai ống nghiệm: Thuốc thử 1 2 Dung dịch protein trứng 0,1% (giọt) 10 10 CuSO4 5% (giọt) 2 Pb(CH3COO)2 5% (giọt) 2 Nhận xét sự tạo thành tủa trong 2 ống. Cho thừa 2 muối vào 2 ống tương ứng. Quan sát sự hòa tan trở lại của tủa. 2.5. Biến tính protein bằng dung môi hữu cơ: Protein kết tủa bông hay bị vẩn đục trong dung môi hữu cơ như alcol, aceton, ether do bị mất lớp áo nước. Tủa càng dễ dàng nếu có thêm các chất điện giải và môi trường trung tính hay hơi acid. Kết tủa protein bằng dung môi hữu cơ có thể thuận nghịch nếu được tiến hành ở nhiệt độ thấp (-150C đến 00C), trong thời gian ngắn và được tách nhanh ra khỏi dung môi. Tiến hành: Cho vào 1 ống nghiệm: - Dung dịch protein trứng 0,1%............................... 5 giọt - Ethanol 95o .15 – 20 giọt Sau đó thêm: - NaCl bão hòa ..1 giọt Nhận xét kết quả. Thực hành Hóa Sinh Học – Khoa Công nghệ ThS. Cao Ngọc Minh Trang 13 Bài 3: PHƯƠNG PHÁP SORENSEN (Phương pháp xác định đạm formol) Các amino acide có thể phản ứng với formol trung tính để tạo thành dẫn suất metylenic. Kết quả là nhóm amin mất tính chất cơ bản của nó, ngược lại nhóm carboxyl ttrong amino acide tồn tại dạng metylen tự do có thể chuẩn độ với NaOH. Phương pháp được ứng dụng trong trường hợp số nhóm carboxyl và nhóm amin tự do bằng nhau. Nguyên liệu và hóa chất: - Dung dịch formol (pha 10ml formol với 2ml dd phenolphtalein 0,5%, dùng NaOH 0,1N trung hòa cho đến khi có màu hồng nhạt và chỉ chuẩn bị trước khi dùng) - Nước mắm, nước cất - Dung dịch NaOH 0,1N - Phenolphtalein 0,5% Dụng cụ: - Ống nghiệm, giá ống nghiệm, cặp ống nghiệm - Bình nón 100ml, 250ml - Bình định mức 100ml - Burret 25ml - Pipette 5 – 10ml Cách tiến hành: - Lấy 2 bình nón: bình 1 dùng làm bình kiểm tra, bình 2 dùng làm bình thí nghiệm - Cho vào bình 1: 10ml nước cất, thêm vào 5ml dd formol và 5ml dd NaOH 0,1N. Sau đó dùng H2SO4 0,1N để hiệu chỉnh màu trong bình cho đến khi chỉ còn màu hồng nhạt, thêm 2 giọt NaOH 0,1N, màu đỏ tưuơi xuất hiện, ứng với pH=8,8. - Cho vào bình 2: 10ml dịch mẫu, thêm 5ml dd formol và chuẩn độ bằng dd NaOH 0,1N đến khi có màu đỏ tươi (đậm hơn màu ở bình kiểm tra). Dùng H2SO4 0,1N để hiệu chỉnh màu của dịch trong bình đến hồng nhạt, sau đó thêm vài giọt NaOH 0,1N để có màu đỏ tươi, tương đương với màu ở bình kiểm tra (pH=8,8) Thực hành Hóa Sinh Học – Khoa Công nghệ ThS. Cao Ngọc Minh Trang 14 - Thêm vào bình 1: 4 giọt NaOH 0,1N, xuất hiện màu đỏ tươi ứng với pH=9,1 - Thêm vào bình 2: vài giọt NaOH 0,1N cho đến khi xuất hiện màu đỏ tươi giống như bình 1 (pH=9,1) Tính kết quả: N (mg%) = [(V2 – v2) – (V1 – v1)] .1,4.100/a V1 là tổng lượng kiềm dùng để chuẩn độ bình kiểm tra 1 v1 là tổng lượng acide dùng để chuẩn độ bình kiểm tra 1 V2 là tổng lượng kiềm dùng để chuẩn độ bình kiểm tra 2 v2 là tổng lượng acide dùng để chuẩn độ bình kiểm tra 2 a là lượng mẫu(g) ứng với 10ml dịch mẫu dùng để xác định N Tính lượng đạm amin N trong mẫu thí nghiệm trên. Thực hành Hóa Sinh Học – Khoa Công nghệ ThS. Cao Ngọc Minh Trang 15 Chương II: ENZYME Bài 1: ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA ENZYME Nhiệt độ có ảnh hưởng quan trọng đến tốc độ phản ứng của enzyme. Sự tăng tốc độ phản ứng của enzyme bằng cách nâng nhiệt độ chỉ có hiệu quả trong một khoảng nhiệt độ tương đối hẹp. Nhiệt độ tối thích của phần lớn các enzyme là trong khoảng 40 – 600C. Càng xa nhiệt độ thích hợp hoạt độ của các enzyme càng giảm. Nguyên liệu và hóa chất: - Dung dịch tinh bột 1% - Nước cất, nước đá - Dung dịch Iod 5mmol/L trong KI 3% - Dung dịch amylase (dd nước bọt pha loãng 10 lần) Dụng cụ: - Ống nghiệm, giá ống nghiệm, cặp ống nghiệm - Tủ ấm điều nhiệt - Giấy lọc - Nồi đun cách thuỷ - Pipet 1 – 5ml - Cốc 100 – 250ml Cách tiến hành: Chuẩn bị 8 ống nghiệm: cho vào ống nghiệm 1 -4 mỗi ống 2ml dd tinh bột 1%. - Ống 1: gia nhiệt ở 85 – 900C - Ống 2: cho vào nước đá - Ống 3: để ở tủ ấm 45 - 500C - Ống 4: để ở nhiệt độ phòng Giữ các ống trong 15 phút để dd trong ống đạt đến các nhiệt độ tương ứng. Thực hành Hóa Sinh Học – Khoa Công nghệ ThS. Cao Ngọc Minh Trang 16 Tiếp tục cho vào mỗi ống 0,5ml dd amylase cũng đã đạt các nhiệt độ trên và đặt các ống nghiệm ở các nhiệt độ cũ. Sau 1, 2, 4, 6, 8 và 12 phút lấy từ mỗi ống 1 giọt, nhỏ vào các giọt dung dịch Iod đã chuẩn bị sẵn trên bản kính. Quan sát màu tạo thành. Nhận xét sự sai khác giữa các mẫu và giải thích. Bài 2: ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC CHẤT HOẠT HÓA VÀ KÌM HÃM ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA ENZYME - Chất hoạt hóa có khả năng làm tăng cường tác dụng của enzyme. - Chất kìm hãm (ức chế) là giảm ái lực của enzyme với cơ chất hay làm enzyme mất khả năng kết hợp với cơ chất. Nguyên liệu và hóa chất: - Dung dịch amylase (dd nước bọt pha loãng 20 lần) - Dung dịch tinh bột 0,5% - Dung dịch NaCl 1% - Dung dịch CuSO4 1% - Dung dịch Lugol - Nước cất Dụng cụ: - Ống nghiệm, giá ống nghiệm, cặp ống nghiệm - Pipette 1 – 5ml Cách tiến hành: Chuẩn bị 3 ống nghiệm, cho vào: Ống 1: 1ml nước cất Ống 2: 1ml dd NaCl 1% Ống 3: 1ml dd CuSO4 1% Cho vào mỗi ống 1ml nước bọt và 1ml dd tinh bột, lắc đều.Sau vài phút, thêm vào mỗi ống vài giọt thuốc thử Lugol, lắc đều và quan sát sự khác nhau giữa các ống. Giải thích kết quả. Thực hành Hóa Sinh Học – Khoa Công nghệ ThS. Cao Ngọc Minh Trang 17 Bài 3: XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ α – AMYLASE THEO PHƯƠNG PHÁP WOHLGEMUTH Các amylase là các enzyme thủy phân tinh bột, có 2 loại là α- amylase và β- amylase. Sự tác dụng của hỗn hợp α- amylase và β- amylase trên tinh bột cho ta hỗn hợp càng lúc càng nhiều glucose, maltose và dextrin đơn giản Để xác định hoạt độ của enzyme, ta xác định nồng độ enzyme thấp nhất có khả năng gây thủy phân hoàn toàn tinh bột cho các sản phẩm không đổi màu dd iode. Đó là nguyên tắc của phương pháp Wohlgemouth. Đơn vị Wohlgemouth là lượng enzyme cần thiết để thủy phân hoàn toàn 1mg tinh bột ở 370C sau 30 phút có chất Cl- làm chất hoạt hóa. Nguyên liệu và hóa chất: - Dung dịch amylase (dd nước bọt pha loãng 10 lần) - Dung dịch tinh bột 0,1% - Dung dịch NaCl 0,9% - Dung dịch Iode 0,02N - Nước cất Dụng cụ: - Ống nghiệm, giá ống nghiệm, cặp ống nghiệm - Pipette 1 – 5ml - Tủ ấm hoặc nồi cách thủy ổn nhiệt (370C) Cách tiến hành: - Chuẩn bị 10 ống nghiệm, đánh số từ 1 – 10, cho vào mỗi ống 1ml dd NaCl 0,9%. - Thêm vào ống 1: 1ml dịch enzyme, lắc đều, lấy ra 1ml cho vào ống 2, lắc kỹ, lấy ra 1ml cho vào ống 3Tiếp tục làm thao tác trên cho đến ống 10, lấy 1ml từ ống 10 bỏ đi. - Sau đó cho vào mỗi ống 2ml dung dịch tinh bột 0,1%, lắc đều và giữ yên ở 37 0C trong 30 phút. Thực hành Hóa Sinh Học – Khoa Công nghệ ThS. Cao Ngọc Minh Trang 18 - Khi thời gian hết, làm nguội các ống nghiệm đến nhiệt độ phòng và cho vào mỗi ống 2 giọt dd Iode 0,02N và lắc đều. Hoạt độ enzyme được tính như sau: X = 2n x 2 (trong đó n là số thứ tự ống nghiệm có nồng độ enzyme thấp nhất và đã thủy phân hoàn toàn). Giải thích kết quả. Giải thích vai trò của NaCl trong thí nghiệm. Tính hoạt độ của enzyme. Thực hành Hóa Sinh Học – Khoa Công nghệ ThS. Cao Ngọc Minh Trang 19 Chương III: GLUCIDE Bài 1: PHẢN ỨNG VỚI THUỐC THỬ FEHLING Do có chứa chức aldehyde hoặc ceton cho nên các monosaccharide có tính khử và được gọi là đường khử. Nếu hai monosaccharide kết hợp với nhau bằng nhóm 2 hydroxyl glucoside thì disacchadide tạo thành bị mất tính khử. Còn nếu nhóm OH glucoside của nhóm này liên kết vơi nhóm OH alcol của monosaccharide kia thì disaccharide tạo thành vẫn còn tính khử. Khi đun đường khử với dd thuốc thử Fehling thì kết tủa đỏ của Cu2O hình thành (do đường khử đã khử Cu(OH)2 có trong Fehling thành CuO2) Nguyên liệu và hóa chất: - Dung dịch Glucose 1%. - Dung dịch Maltose 1%. - Dung dịch Saccharose 1% - Thuốc thử Fehling A (CuSO4). - Thuốc thử Fehling B (Seignet + NaOH). Dụng cụ: - Ống nghiệm, giá ống nghiệm, cặp ống nghiệm - Pipette 1 – 5ml - Cốc 250ml - Đèn cồn, bếp điện Cách tiến hành: Lấy ba ống nghiệm, đánh số từ 1 – 3 như sau: - Ống 1: cho 2 ml glucose 1% + 1ml Fehling A + 1ml Fehling B + đun trong 5 phút. - Ống 2: cho 2 ml maltose 1% + 1ml Fehling A + 1ml Fehling B + đun trong 5 phút. - Ống 3: cho 2 ml saccharose 1% + 1ml Fehling A + 1ml Fehling B + đun trong 5 phút. Nhận xét và giải thích kết quả. Thực hành Hóa Sinh Học – Khoa Công nghệ ThS. Cao Ngọc Minh Trang 20 Bài 2: PHẢN ỨNG SELIWANOFF Fructose và các cetohexose khác khi đun nóng với acide sẽ tạo thành oxymethylfurfural, chất này khi tác dụng với resorcin sẽ cho màu đỏ đặc trưng. Đây là phản ứng đặc hiệu với cetose Nguyên liệu và hóa chất: - Dung dịch fructose 1% - Dung dịch glucose 1% - Dung dịch NaCl 1% - Thuốc thử Seliwanoff Dụng cụ: - Ống nghiệm, giá ống nghiệm, cặp ống nghiệm - Pipette 1 – 5ml - Đèn cồn Cách tiến hành: Cho vào mỗi ống nghiệm 2ml thuốc thử Seliwanoff và thêm vào: - Ống 1: 2ml dd fructose 1% - Ống 2: 2ml dd glucose 1% - Ống 3: 2ml nước cất Tất cả đun cách thủy trong 5 phút. Nhận xét và giải thích kết quả. Thực hành Hóa Sinh Học – Khoa Công nghệ ThS. Cao Ngọc Minh Trang 21 Bài 3: XÁC ĐỊNH ĐƯỜNG KHỬ BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ KẾ Các loại đường khử có khả năng khử Ferricyanur (Fe3+) thành Ferrocyanur (Fe2+) ion này có màu xanh đậm (xanh prusse). Do đó ta có thể dùng phương pháp so màu để định lượng đường. Chuẩn bị mẫu: 1g nguyên liệu (thơm, nho, chuối) + H2SO4 10% (ngập mẫu), đun cách thủy khoảng 1giờ, lấy ra cho NaOH vào để trung hòa đến pH =7, lọc nếu có cặn ta được dung dịch mẫu. Lấy 1ml dd mẫu pha loãng thành 30 – 100ml dd dùng để xác định đường khử. Dụng cụ: - Ống nghiệm, giá ống nghiệm, cặp ống nghiệm, - Bếp đun cách thủy, cối giã, chày - Pipet 1ml, pipet 2ml - Cốc 250ml, cốc thủy tinh 500 ml - Máy quang phổ - Giấy lọc, bình tam giác, ống đong 100ml. Hóa chất: • Dung dịch glucose 0,02mg/ml. • Nước cất, nước đá • Thuốc thử A (Na2CO3 + KCN / H2O cất) • Thuốc thử B (K3Fe(CN)6 / H2O cất) • Thuốc thử C (Fe[NH4(SO4)2] + Lauryl sulfat / H2SO4) Cách tiến hành Thực hiện 9 ống nghiệm theo mẫu sau: Thực hành Hóa Sinh Học – Khoa Công nghệ ThS. Cao Ngọc Minh Trang 22 Số ống 1 2 3 4 5 6 7 8 9 ml glucose 0,02mg/ml 0 0 0,05 0,1 0,2 0,4 0,6 ml nước cất 1 1 0,95 0,9 0,8 0,6 0,4 ml đường định nồng độ 1 2 Nồng độ đường trong mỗi ống chuẩn (g/ml) 0 0 1 2 4 8 12 X1 X2 Dùng quả bóp cao su cho vào mỗi ống 1 ml thuốc thử A và 1 ml thuốc thử B, lắc đều, đun sôi cách thủy 15 phút. Làm lạnh, thêm 5 ml thuốc thử C, lắc đều, để yên 15 phút. Đo ở Mode “Absorbance” với độ dài sóng 690 nm. Vẽ đồ thị theo nồng độ đường và độ hấp thu. Thực hành Hóa Sinh Học – Khoa Công nghệ ThS. Cao Ngọc Minh Trang 23 Chương 4: VITAMIN Bài 1: PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH VITAMIN A Dưới tác dụng của H2SO4 đậm đặc, vitamin A bị mất nước và tạo thành sản phẩm ngưng tụ có màu không bền. Sau đó biến đổi nhanh thành màu đặc trưng của lipocrom (nâu đen). Nguyên liệu và hóa chất - Dung dịch H2SO4 đđ - Cloroform đđ. - Dầu cá. Dụng cụ: - Ống nghiệm, kẹp ống nghiệm, bình tia. Cách tiến hành: Nhỏ 1 giọt dầu cá hòa tan trong 25 giọt Cloroform, sau đó cho 1 giọt H2SO4 đđ vào rồi lắc đều. Nhận xét kết quả. Bài 2: PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH VITAMIN C Khi trộn dd acid ascorbic với dd xanh metylen thì dd sẽ mất màu. Phản ứng xảy ra do acid ascorbic bị oxy hóa thành acid dehydro ascorbic và xanh metylen trở thành dạng không màu. Hóa chất: - Dd Vitamin C - Xanh metylen 0,01% - Dd NaOH 5% Dụng cụ: - Ống nghiệm, kẹp ống nghiệm, bình tia, Thực hành Hóa Sinh Học – Khoa Công nghệ ThS. Cao Ngọc Minh Trang 24 - Bếp đun cách thủy. - Nhiệt kế, bình tia, cốc 250ml. Cách tiến hành: - Ống 1: 1ml dd vitamin C. - Ống 2: 1ml nước cất. Thêm vào mỗi ống 1 – 2 giọt xanh metylen và 2 – 3 giọt NaOH 5%. Lắc đều. Quan sát màu. Nếu không có sự thay đổi màu, đặt cả 2 ống nghiệm vào nồi cách thủy 37 – 400C. Quan sát màu dd trong ống nghiệm sau vài phút. Giải thích và ghi kết quả Bài 3: PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VITAMIN C Để xác định hàm lượng vitamin C trong nguyên liệu bằng phương pháp chuẩn độ iod người ta cho tất cả acid ascorbic bị oxy hóa bởi iod, phần iod còn thừa sẽ cho màu xanh với dung dịch tinh bột. Điều đó nói lên phản ứng đã kết thúc. Nguyên liệu và hóa chất: - Dd HCl 5%. - Dd I2 0,01N. - Dd tinh bột 1%. - Chanh trái, bưởi, cam. Dụng cụ: - Cối sứ, chày sứ - Bình tam giác 250ml. - Pipet 1ml, 2ml, 5ml, 10ml - Cốc thủy tinh 250ml, 500ml - Burette 25ml, bình định mức 50ml - Dao nhỏ. Thực hành Hóa Sinh Học – Khoa Công nghệ ThS. Cao Ngọc Minh Trang 25 Cách tiến hành: - Cho vào cối sứ 5g thịt trái chanh và 10ml HCl 5%, nghiền nhỏ đến dạng đồng thể, dùng nước cất chuyển toàn bộ dịch chiết đồng thể vào bình định mức 50ml, thêm nước cất đến vạch. Lắc đều, lọc cặn vào trong tam giác 250ml, ta có dd mẫu hay dd nguyên liệu. - Nạp dd I2 0,01N vào burette. - Hút 20 ml dd nguyên liệu cho vào bình nón, thêm 5 - 10 giọt hồ tinh bột 1%. - Chuẩn độ bằng dung dịch I2 0,01N cho đến khi xuất hiện màu xanh lam nhạt. - Lập lại chuẩn độ 3 lần, lấy kết quả trung bình ta được V(ml) là số ml I2 0,01N dùng để chuẩn độ vitamin C. Tính kết quả: V . V1 . 0,00088 . 100 X (%) = V2 . m X: hàm lượng vitamin C (%) m: lượng mẫu thí nghiệm (5gr) 0,00088: số gram acid ascorbic ứng với 1ml dd I2 0,01N V1: thể tích dd mẫu (50ml) V2: thể tích dịch mẫu lấy để xác định (20ml) V: số ml dd Iode 0,01N dùng để chuẩn độ Tính hàm lượng vitamin C trong mẫu thí nghiệm. Thực hành Hóa Sinh Học – Khoa Công nghệ ThS. Cao Ngọc Minh Trang 26 Chương 5: LIPIT Bài 1: XÁC ĐỊNH CHỈ SỐ PEROXIDE Khi có oxy không khí các acide béo có trong thành phần của mỡ, nhất là các acide béo không no dễ dàng bị oxy hóa một phần và tạo thành peroxide. Hiện tượng này xảy ra khi mỡ bị ôi hay bị khô.Việc xác định chỉ số peroxide có thể dựa vào phản ứng sau: R-CH-CH-R’-COOH + 2KI + 2CH3COOH O - O R-CH-CH-R’-COOH + I2 + 2CH3COOK + H2O O Lượng iode giải phóng ra có thể chuẩn độ được bằng dung dịch natri hiposulfit: 2Na2S2O3 + I2 = 2NaI + Na2S4O6 Theo lượng hyposulfite cần để liên kết iode giải phóng ra, có thể tính được chỉ số peroxide. Chỉ số peroxide là số gam iode được giải phóng ra bởi peroxide có trong 100g lipide. Nguyên liệu và hóa chất: - Dầu thực vật - Acide acetide đặc - Clorofom tinh khiết - Dung dịch KI bão hòa (pha dung ngay) - Dung dịch Na2S2O3 0,002N - Dung dịch tinh bột 0,5% Dụng cụ: - Bình tam giác - Pipet , ống đong. - Burrette Thực hành Hóa Sinh Học – Khoa Công nghệ ThS. Cao Ngọc Minh Trang 27 Cách tiến hành Lấy 2 bình tam giác đánh số thứ tự 1, 2 sau đó làm như sau: - Cho vào bình 1 (bình thí nghiệm): 2g dầu thực vật - Cho vào bình 2 (bình kiểm tra): 2ml nước cất - Thêm vào mỗi bình 20ml hỗn hợp acide acetic đặc: clorofom (tỷ lệ 2:1) về thể tích, 5ml dd KI bão hòa, lắc đều, đậy nút và đặt chỗ tối 10 phút. - Sau đó them 30ml nước cất, vài giọt dd tinh bột 0,5%, chuẩn độ iode giải phóng ra bằng dd Na2S2O3 0,002N đến khi mất màu xanh. Chỉ số peroxide được tính theo công thức: (A – B). 0,0002538.100 X = A Trong đó: A: số ml Na2S2O3 đã dùng để chuẩn độ bình thí nghiệm B: số ml Na2S2O3 đã dùng để chuẩn độ bình kiểm tra 0,0002538 là số gam iode tương ứng với 1ml dd Na2S2O3 0,002N a: số gam dầu lấy để xác định trong thí nghiệm. Tính chỉ số peroxide trong thí nghiệm. Thực hành Hóa Sinh Học – Khoa Công nghệ ThS. Cao Ngọc Minh Trang 28 Bài 2: XÁC ĐỊNH CHỈ SỐ IOD CỦA CHẤT BÉO Chỉ số iod của chất béo là số gram iod kết hợp với 100gr chất béo. Xác định chỉ số iod là dựa trên khả năng của iod kết hợp được với acid béo ở chỗ những liên kết đôi, vì mỗi nối đôi của lipit sẽ cho phản ứng cộng với 2 nguyên tử của nhóm halogen. Do đó, nếu ta cho chất béo tác dụng với một lượng thừa iod và xác định lượng thừa ấy giúp ta suy ra chỉ số iod. Như vậy chỉ số iod xác định tổng quát các acid béo không no trong chất béo. Nguyên liệu và hóa chất: - Dầu ăn. - Cồn 960 - Dd I2 0,1N - Dd Na2S2O3 0,1N chuẩn - Dd tinh bột 1% Dụng cu: - Bình tam giác có nút nhám - Pipet 2ml, pipet 1ml, pipet 10 ml - Cốc 100ml, 250ml - Burette, ống đong. Cách tiến hành: Lấy 2 bình tam giác có nút nhám: - Cho vào bình 1 (mẫu trắng): 1 ml nước cất - Cho vào bình 2 (mẫu nguyên liệu): 1 2g dầu ăn. - Thêm vào mỗi bình 10ml cồn 960 lắc đều, thêm 10ml I2 0,1N. - Để yên trong tối từ 10 đến 15 phút, rồi sau đó chuẩn độ bằng Na2S2O3 0,1N đến khi dung dịch có màu vàng nhạt thì thêm vào mỗi bình 1ml dd tinh bột 1%, và tiếp tục chuẩn độ đến khi mất màu xanh. - Lập lại thí nghiệm trên 3 lần. Thực hành Hóa Sinh Học – Khoa Công nghệ ThS. Cao Ngọc Minh Trang 29 Tính chỉ số iod: ( B – A ) . 0,0127 . 100 Chỉ số I2 = m Trong đó: A: số ml Na2S2O3 0,1N dùng chuẩn độ mẫu trắng B: số ml Na2S2O3 0,1N dùng chuẩn độ mẫu nguyên liệu m: trọng lượng mẫu tính bằng gram 0,0127: số gram iod ứng với 1ml Na2S2O3 0,1N Giải thích và tính chỉ số I2 trong thí nghiệm. Bài 3: XÁC ĐỊNH CHỈ SỐ ACID CỦA CHẤT BÉO Chỉ số acid của chất béo là số miligram KOH cần thiết để trung hòa hết những acid béo tự do chứa trong 1gam chất béo. Dùng KOH 0,1N để trung hòa các acid béo tự do trong nguyên liệu với phenolphtlein làm chất chỉ thị màu Nguyên liệu và hóa chất: - Dầu ăn tinh luyện. - Cồn tuyệt đối 980. - Dd KOH 0,1N chuẩn. - Chỉ thị phenolphtalein 1%. Dụng cụ: - Bình tam giác 250ml - Pipet 2ml, pipet 1ml, pipet 10 ml Thực hành Hóa Sinh Học – Khoa Công nghệ ThS. Cao Ngọc Minh Trang 30 - Cốc 100ml, 250ml - Burette 25ml - Cân Cách tiến hành: Trong bình tam giác 250ml, cân khoảng từ 5gam dầu ăn và thêm vào đó 50ml cồn 980 để hòa tan dầu ăn. Đun nhẹ ở 600C trong nồi cách thủy, vừa đun vừa lắc. Nạp dd KOH 0,1N vào burette Chuẩn độ nhanh bằng KOH 0,1N chuẩn khi dung dịch còn hơi ấm, với chỉ thị phenolphtalein 1% cho đến khi có màu hồng nhạt bền trong 30 giây. Làm lập lại 3 lần lấy thể tích trung bình. Tính chỉ số acid: 5,61 . V Chỉ số Acid = m 5,61: số mg KOH ứng với 1 ml KOH 0,1N V: số ml KOH 0,1N dùng để chuẩn độ m: trọng lượng chất béo đã cân. Giải thích và tính chỉ số acide trong thí nghiệm. Thực hành Hóa Sinh Học – Khoa Công nghệ ThS. Cao Ngọc Minh Trang 31 Bài 4: XÁC ĐỊNH LIPIT TỔNG SỐ (LẮP BỘ SOXHLET, GIẢNG TRÊN MÔ HÌNH) Dùng dung môi kỵ nước trích ly hoàn toàn lipide từ nguyên liệu đã được nghiền nhỏ. Một số thành phần hòa tan trong chất béo cũng được trích ly theo, bao gồm sắc tố, các vitamin tan trong chất béo, các chất mùi tuy nhiên hàm lượng của chúng thấp. Do có lẫn tạp chất, phần trích ly được gọi là lipide tổng hay lipide thô Có 2 phương pháp để xác định: • Phương pháp xác định trực tiếp: chiết xuất lipide ra khỏi nguyên liệu và cân trực tiếp • Phương pháp xác định gián tiếp: chiết xuất lipide ra khỏi nguyên liệu và cân lại nguyên liệu Nguyên liệu và hóa chất: - Dung môi chiết xuất lipide thường dùng là ether etylic - Nguyên liệu được nghiền nhỏ, sấy khô đến khối lượng không đổi Thiết bị Soxhlet: - Bình cầu dung tích 100 – 300ml - Trụ chiết - Ống sinh hàn Cách tiến hành: - Chuẩn bị túi bằng giấy lọc để đựng nguyên liệu hoặc dùng ống hình trụ đựng mẫu có sẵn (túi giấy lọc được cắt hình chữ nhật, chiều dài gấp 2,5 lần chiều rộng, gấp thành túi trụ có đường kính bé hơn trụ chiết). Túi được sấy khô đến khối lượng không đổi và được cân trên cân phân tích (nếu xác định theo phương pháp gián tiếp) - Cân chính xác 2 – 5g rồi cho mẫu vào túi giấy. Gấp kín mép túi, đặt túi có mẫu phân tích vào trụ chiết. Thực hành Hóa Sinh Học – Khoa Công nghệ ThS. Cao Ngọc Minh Trang 32 Phương pháp xác định trực tiếp: Trước khi chiết, bình cầu được sấy khô đến khối lượng không đổi. Đặt bình cầu lên nồi cách thủy và cho ete vào ½ thể tích bình Cho túi nguyên liệu vào trụ chiết Lắp trụ chiết vào bình cầu Cho dung môi vào trụ chiết đến ngập túi nguyên liệu. Mức dung môi đến phần trên ống xifon trụ chiết Lắp ống sinh hàn, ngâm nguyên liệu trong dung môi một vài giờ Đặt máy Soxhlet vào nồi cách thủy sao cho số lần dung môi rút từ trụ chiết xuống bình cầu khoảng 10 – 15 lần trong 1 giờ Thử lipide đã chiết hết chưa bằng cách lấy một vài giọt ete từ đầu cuối trụ chiết cho lên đĩa kính đồng hồ sạch. Cho bay hơi hết ete. Nếu không có lipide trên đĩa kính, xem như lipide đã được chiết hoàn toàn Khi chiết xong, lấy bình cầu ra, lắp ống sinh hàn vào và cất lấy ete Sấy bình cầu có chứa lipide (60 -700C trong 30 phút) đến khối lượng không đổi rồi đem cân. Tính kết quả: Hàm lượng lipide có trong 100g mẫu nguyên liệu: (a – b). 100 X = c X: hàm lượng lipide tính theo % a: khối lượng bình và lipide (g) b: khối lượng bình (g) c: khối lượng mẫu đã tách lipide (g) Thực hành Hóa Sinh Học – Khoa Công nghệ ThS. Cao Ngọc Minh Trang 33 Phương pháp xác định gián tiếp: Sau khi kết thúc thí nghiệm như trên, lấy túi mẫu nguyên liệu ra khỏi bình chiết, cho bay hơi hết dung môi, sấy khô đến trọng lượng không đổi Tính kết quả: Hàm lượng lipide có trong 100g mẫu nguyên liệu: (a – b). 100 X = c X: hàm lượng lipide tính theo % a: khối lượng túi mẫu nguyên liệu trước khi chiết (g) b: khối lượng túi mẫu nguyên liệu sau khi đã chiết (g) c: lượng nguyên liệu lấy để xác định các chỉ số của chất béo (lipide) Thực hành Hóa Sinh Học – Khoa Công nghệ ThS. Cao Ngọc Minh Trang 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. PGS.TS. Đào Kim Chi và cộng sự (2015). Giáo trình Thực tập Hoá Sinh. Trường ĐH Dược Hà Nội. 2. Nguyễn Quang Vinh, Bùi Phương Thuận, Phan Tuấn Nghĩa (2007). Thực tập Hóa Sinh Học. NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội Thực hành Hóa Sinh Học – Khoa Công nghệ ThS. Cao Ngọc Minh Trang 35 PHỤ LỤC Cách pha 1 số loại thuốc thử và hóa chất của bài thực hành 1) Dung dịch phenolphtalein 1%: hòa tan 0,1g phenolphtalein ttrong 80ml ethanol 96% và thêm nước cất vừa đủ 100ml 2) Thuốc thử Fehling: Fehling A : Fehling B = 1:1 ( chỉ pha trộn khi làm thí nghiệm) Fehling A: 40g CuSO4.5H2O và định mức đến 1l Fehling B: 200g Natri Kali tartrate + 150g NaOH, định mức đến 1l 3) Dung dịch Lugol: