Bài giảng Vệ sinh an toàn thực phẩm - Chương 4: Phân tích vi sinh vật - Văn Hồng Thiện

PHÂN TÍCH VSV CAÙC PHÖÔNG PHAÙP PHAÂN TÍCH ÑÒNH LÖÔÏNG VI SINH VAÄT I. PHƯƠNG PHÁP ĐẾM TRỰC TIẾP - Dùng để xác định các loại vi sinh vật đơn bào có kích thước lớn: nấm men, tảo đơn bào, bào tử mốc - Quy trình cho phép xác định nhanh chóng số lượng vi sinh vật -Không phân biệt được tế bào sống và chết -Không phân biệt được các tế bào vi sinh vật và hạt vật thể -Hạn chế đối với huyền phù có mật độ thấp Buồng đếm vi sinh vật Đếm trực tiếp bằng buồng đềm hồng cầu I. PHƯƠNG PHÁP ĐẾM TRỰC TIẾP Đếm trực tiếp bằng buồng đềm hồng cầu trên kính hiển vi I. PHƯƠNG PHÁP ĐẾM TRỰC TIẾP Đếm trực tiếp bằng buồng đếmhồng cầu Pha loãng mẫu cần đếm sao cho trong mỗi ô nhỏ của buồng đếm có khoảng 5 - 10 tế bào Cách đếm tế bào trong buồng đếm 1. Đếm trực tiếp bằng buồng đềm hồng cầu Quy trình: - Pha loãng mẫu (5-10 tế bào/ô nhỏ) - Nạp mẫu vào buồng đếm - Đếm số lượng tế bào hiện diện trong 5 ô lớn Tính mật độ: Mật độ tế bào: N/ml = 0,25a x 106 tế bào/ml a: trung bình cộng số lượng tế bào trong 5 ô lớn I. PHƯƠNG PHÁP ĐẾM TRỰC TIẾP II. PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC - Dùng để xác định các loại vi sinh vật sống trong mẫu - Độ nhạy cao, định lượng vi sinh vật ở mật độ thấp - Có thể định lượng các vi sinh vật kích thước nhỏ, di động Chuẩn bị dịch pha loãng mẫu Không sử dụng nước cất và nước muối sinh lý để pha loãng mẫu thực phẩm Các dung dịch pha loãng mẫu • Buffered peptone water (BPW)
Saline peptone water (SPW) NaCl 8,5g Peptone 1,0g Nước cất vừa đủ 1 lít NaCl 5g Peptone 10g Nước cất vừa đủ 1 lít Chuẩn bị các chuỗi pha loãng mẫu pha loãng mẫu lỏng theo dãy thập phân Đối với các mẫu rắn hay bán lỏng: 10g mẫu + 90ml dung dịch pha loãng => độ pha loãng 101 Các bước tiếp theo tương tự như pha loãng mẫu lỏng Film II. PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠCQuy trình: - Pha loãng mẫu (25-250 khuẩn lạc/đĩa) - Tạo hộp đổ - Nuôi ủ, đếm số lượng Cấy mẫu vào môi trường -Phương pháp cấy bềmặt - Phương pháp đổ đĩa Phương pháp đổ đĩa • Chuẩn bị đĩa petri vô trùng • Môi trường được chuẩn bị - hấp khử trùng và được bảo quản mát ở 45oC trong bể điều nhiệt • Hút 1ml mẫu vào đĩa trống (chọn nồng độ thích hợp) • Đổ vào đĩa đã cấy 10 – 15ml môi trường, lắc đều • Để nguội môi trường Phương pháp đổ đĩa Ưu điểm Cấy được thể tích mẫu lớn (1ml) Xác định được các VSV cần dinh dưỡng tiếp xúc từ nhiều phía Cho phép đếm được mật độ VSV cao, khoảng 150-300 khuẩn lạc Nhược điểm Không định lượng được những VSV quá nhạy nhiệt Không xác định được hình dạng khuẩn lạc nhất định Khó làm thuần một dòng VSV Phương pháp cấy bề mặt • Môi trường phải được chuẩn bị trên đĩa trước 1-2 ngày để khô mặt • Phương pháp - Cấy 0.1 – 0,3ml vào đĩa môi trường - Trải đều trên mặt bằng que trang tam giác - Để ở nhiệt độ phòng 15-20 phút cho khô mặt Film Phương pháp cấy bề mặt Ưu điểm - Định lượng được các VSV nhạy nhiệt - Có thể nhận dạng đựơc dạng khuẩn lạc đặc trưng - Dễ dàng làm thuần chủng VSV mục tiêu Nhược điểm - Chỉ cấy đựơc thể tích mẫu nhỏ Bút đếm khuẩn lạc Các thiết bị hỗ trợ đếm khuẩn lạc Các thiết bị hỗ trợ đếm khuẩn lạc Máy đếm khuẩn lạc Máy đếm khuẩn lạc tự động II. PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC Tính kết quả: Vôùi : N: soá teá baøo (ñôn vò hình thaønh khuaån laïc) vi khuaån trong 1g hay 1ml maãu. ΣC: Toång soá khuaån laïc ñeám ñöôïc treân caùc hoäp petri ñaõ choïn ni : Soá hoäp petri caáy taïi ñoä pha loaõng thöù i di: heä soá pha loaõng töông öùng. v: theå tích dòch maãu (ml) caáy vaøo trong moãi ñóa )...()//( 11 iivdnvdn C mlghayCFUCFUN ++ = ∑ Ñònh löôïng toång vi sinh vaät hieáu khí 10 g mẫu + 90 g Salin Pepton Watter Đồng nhất bằng stomacher / 30 giây Dung dịch 10 -1 Pha lõang 10-2, 10-3, 10-4,.. Cấy 1ml/petri – 3 độ pha loãng liên tiếp – 2 petri/độ pha lõang Cho 15-20 ml PCA/petri. Lắc đều Tổng VSV hiếu khí/g (TPC) N TPC = n1V1F1 + .+ niViFi N: Tổng KL; n: số đĩa cho mỗi nồng độ V: Thể tích cấy (=1) ; F: độ pha lõang Ñònh löôïng toång vi sinh vaät hieáu khí Để đông đặc Lật ngược đĩa, ủ ấm 30±1oC/ 72±6h Khuẩn lạc Chọn đĩa có 25 – 250 khuẩn lạc
đếm III. PHƯƠNG PHÁP DÙNG MÀNG LỌC - Định lượng vi sinh vật có mật độ thấp - Định lượng thông qua số lượng khuẩn lạc hoặc theo phương pháp MPN III. PHƯƠNG PHÁP DÙNG MÀNG LỌC - Kích thước lỗ lọc: 0,45 µm hoặc 0,2 µm - Thường dùng màng lọc kỵ nước, in các ô vuông ngăn cản sự mọc lan của khuẩn lạc III. PHƯƠNG PHÁP DÙNG MÀNG LỌC Bộ lọc và màng lọc vô trùng III. PHƯƠNG PHÁP DÙNG MÀNG LỌC III. PHƯƠNG PHÁP DÙNG MÀNG LỌC Phương pháp màng lọc • Kích thước lỗ lọc 0,47µm hay 0,22µm • Đường kính và hình dạng màng lọc phụ thực vào đường kính phễu lọc • Đường kính màng thường là 45mm Thiết bị lọc nhiều phễu VSV Phương pháp lọc VSV • Phễu lọc, giá đỡ màng lọc phải được vô trùng sau mỗi lần lọc • Mật độ VSV trong dịch lọc thích hợp: <150 khuẩn lạc/màng • Thể tích dịch lọc trong 1 lần: 50 - 100ml • Nếu thể tích dịch lọc nhỏ hơn thì phải pha loãng bằng dd pha loãng hay nước cất vô trùng Phương pháp màng lọc •Ưu điểm –Xác định được mật độ VSV cụ thể trong một thể tích mẫu lớn: 10ml, 100ml • Nhược điểm –Không thích hợp cho việc phân tích các mẫu thực phẩm rắn Khuẩn lạc vsv mọc trên màng 1A 1B 1C 1D . 2A 2B 2C 2C E. coli trên môi trường ID Coli agar Coliforms trên môi trường ID Coli agar III. PHƯƠNG PHÁP DÙNG MÀNG LỌCQuy trình: - Khử trùng dụng cụ lọc - Lọc chân không - Nuôi cấy màng lọc trên môi trường dinh dưỡng - Đếm số lượng khuẩn lạc trên đĩa petri Tính mật độ: MPN = N x ln(N/N - x) Với: N: Tổng số các ô vuông x: số ô có khuẩn lạc mọc III. PHƯƠNG PHÁP DÙNG MÀNG LỌC III. PHƯƠNG PHÁP DÙNG MÀNG LỌC III. PHƯƠNG PHÁP DÙNG MÀNG LỌC III. PHƯƠNG PHÁP DÙNG MÀNG LỌC III. PHƯƠNG PHÁP DÙNG MÀNG LỌC III. PHƯƠNG PHÁP DÙNG MÀNG LỌC Vi khuẩn phát triển trên màng lọc IV. PHƯƠNG PHÁP DÙNG PETRIFILM- Kỹ thuật dùng kiểm tra tổng vi khuẩn hiếu khí, coliform, coliform phân, nấm mốc, nấm men - Kỹ thuật dễ thao tác - Tiết kiệm không gian ủ, bảo quản, thời hạn sử dụng lâu - Không cần hấp khử trùng môi trường IV. PHƯƠNG PHÁP DÙNG PETRIFILM IV. PHƯƠNG PHÁP MPN (MOST PROBABLE NUMBER) - Đánh giá số lượng vi sinh vật theo số lượng vi sinh vật có xác suất lớn nhất hiện diện trong một đơn vị thể tích mẫu - Là phương pháp định lượng dựa trên kết quả định tính của một loạt thí nghiệm được lặp lại ở một số độ pha loãng khác nhau - Kết quả định tính: sinh hơi, đổi màu, hoá đục của môi trường nuôi cấy → dương tính - Độ chính xác phụ thuộc vào số ống nghiệm lặp lại ở mỗi độ pha loãng (3 hoặc 5 lần) - Phương pháp dùng định lượng mọi nhóm vi sinh vật nuôi trên môi trường chọn lọc, cho kết quả biểu kiến.  Phương pháp MPN dựa trên nguyên tắc xác suất thống kê sự phân bố VSV trong các độ pha loãng khác nhau của mẫu. Mỗi độ pha loãng được nuôi cấy lập lại nhiều lần (3 – 10 lần) Các độ pha loãng được chọn lựa sao cho trong các lần lặp lại có một số lần dương tính và có một số lần âm tính. Số lần dương tính được ghi nhận và so sánh với bảng thống kê  giá trị ước đoán số lượng VSV trong mẫu. ĐỊNH LƯỢNG VSV BẰNG PP MPN (Most Probable Number) • Hai hệ thống MPN - Hệ thống 9 ống - Hệ thống 15 ống • Đặc điểm - Vi sinh vật mục tiêu phải có những biểu hiện đặc trưng trên môi trường nuôi cấy như Sự tạo hơi: Coliforms Sự đổi màu: S. aureus - Cho phép định lượng được mật độ VSV thấp trong thể tích mẫu lớn ĐỊNH LƯỢNG VSV BẰNG PP MPN Hệ thống MPN/g(ml) Hệ thống 9 ống 10ml mỗi trường Hệ thống 15 ống ĐỊNH LƯỢNG VSV BẰNG PP MPN 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 1 - Chuẩn bị các ống nghiệm có chứa môi trường thích hợp cho sự tăng trưởng của đối tượng VSV cần định lượng 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 10-1 1ml 10-2 1ml 10-3 1ml 2 - Cấy một thể tích chính xác dung dịch mẫu ở 3 nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếp 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3 – Đem ống nghiệm ủ ở điều kiện thích hợp 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 4 – Quan sát các biểu hiện chứng minh sự phát triển của vsv cần kiểm định Sự đổi màu của môi trường 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 5 – Ghi nhận số lượng các ống nghiệm dương tính ở từng độ pha loãng 5 2 1 + + + + + + + + 5 – Tra bảng Mac Crady để suy ra mật độ VSV 5 2 1 Tra bảng Số vsv: 70 MPN/g Kết quả ĐỊNH LƯỢNG VSV BẰNG PP MPN 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 10-1 10-2 10-3 1ml 1ml 1ml 5 2 1 Tra Bảng Số vsv: 70 MPN/ml IV. PHƯƠNG PHÁP MPN (MOST PROBABLE NUMBER) Phương pháp MPN (loạt 5 ống) IV. PHƯƠNG PHÁP MPN (MOST PROBABLE NUMBER)Bảng tra MPN (loạt 3 ống) -333 1100233 460133 240033 9300 6200 3100 -000 0,1110 Số ml mẫu sử dụng Số MPN/100 ml Số lượng ống dương tính PHÁP MPN (MOST PROBABLE NUMBER) Bảng tra MPN (loạt 5 ống) IV. PHƯƠNG PHÁP MPN (MOST PROBABLE NUMBER)Quy trình: - Pha loãng mẫu bậc 10,chọn 3 nồng độ liên tiếp - Cấy vào loạt ống nghiệm (9 hoặc 15 ống) chứa môi trường chọn lọc một lượng mẫu xác định từ 3 nồng độ đã chọn - Nuôi ủ, xác định số ống dương tính ở 3 nhóm - Tra bảng Mac Crady→trị số MPN (a) Tính mật độ: Số MPN/100ml (MPN/1g) = a x x d Với: a: trị số tra từ bảng Mac Crady V2: thể tích mẫu sử dụng (thường là 1) V1: thể tích mẫu theo bảng Mac Crady ở loạt ống đầu tiên (10ml) d: độ pha loãng ở loạt ống đầu tiên 1 2 V V Key xác định E.coliNhuộm Gram Gram + Gram - Hình dạng Hình queHình cầu Test oxydase Lên men lactose Key xác định E.coli Lên men lactose Sinh trưởng trên citrate Sinh indol Nhận biết E. coli và Coliforms Choïn khuaån laïc deït, coù aùnh kim tím, ñöôøng kính khoaûng 1mm ñeå caáy sang TSA hay BHI Laáy 10g (10ml) maãu ñoàng nhaát vaøo 90ml nöôùc muoái sinh lyù, ñöôïc 10-1 Choïn oáng (+), caáy sang canh EC, uû 44.0 ± 0.5oC trong 24-48 giôø Choïn caùc oáng sinh hôi caáy sang Endo Maãu khoâng sinh hôi ñöôïc coi laø aâm tính E. coli UÛ ôû 37.0 ± 0.5oC trong 24 giôø Pha loaõng maãu 10-2, 10-3, 10-4 Chuyeån 1ml dung dòch 10-2, 10-3, 10-4 vaøo 10ml canh BGBL, moãi noàng ñoä 3 oáng laëp laïi, uû 37oC, 36h XÑ soá oáng (+) ôû moãi ñoä pha loaõng Coliform Quy trình phaân tích coliform vaø E. coli UÛ ôû 37.0 ± 0.5oC qua ñeâm Keát luaän: Phaùt hieän (khoâng phaùt hieän) E.coli/g Caáy chuyeån vaøo caùc moâi tröôøng thöû nghieäm sinh hoaù: Canh trypton (1), MRVP (2), Simmon Citrate (1) ñeå thöû nghieäm phaùp IMViC E. coli coù bieåu hieän sinh hoaù: Indol (+), MR (+), VP (-), Citrate (-). Moät trong soá caùc phaûn öùng treân sai laø khoâng phaûi E.coli Môi trường Brillant Green Lactose Bile Broth Nhận biết E coli và Coliforms + Môi trường E.coli broth (EC) – dương tính Nhận biết E. coli và Coliforms + Nhận biết E. coli và Coliforms Môi trường Eosin Metyl Bile (EMB) – dương tính
Coliform phân hay E.coli giả định Nhận biết E. coli và Coliforms Môi trường Eosin Metyl Bile (EMB) – dương tính
Coliform phân hay E.coli giả định Nhận biết E. coli Phản ứng IMViC Phản ứng Indol dương tính
E.coli Đối chứng − + Nhận biết E. coli Phản ứng IMViC Phản ứng methyl red (MR) dương tính
E.coli ++ − Đối chứng Methyl red Nhận biết E. coli Phản ứng IMViC Phản ứng Voges-Proskauer (VP) âm tính
E.coli Thuốc thử VP − Đối chứng + − Đối chứng Đối chứng Đỏ tươiĐỏ đồng + − Nhận biết E. coli Phản ứng IMViC Môi trường Simmons Citrate âm tính
E.coli − Đối chứng + + Nấm men và nấm mốc • Thuộc nhóm vsv dị dưỡng, có nhân thật, rất đa dạng Nấm Men •Tế bào đơn tính •Sinh sản theo kiểu nảy chồi Nấm Mốc •Tế bào dạng sợi •Sinh sản bằng bào tử hay khuẩn ty Nấm men và nấm mốc • Nhiệt độ thích hợp 20 – 28oC • pH thích hợp 2 – 9, pH tối ưu 4 – 6,5 • Thuộc nhóm hiều khí bắt buộc, một số ít thuộc nhóm vi hiếu khí • Khi phát triển trong thực phẩm làm đổi màu, tạo mùi lạ, làm hư hỏng, thay đổi cấu trúc thực phẩm, một số loài còn sinh độc tố. Quy trình phân tích định tính Đồng nhất mẫu trong SDB thành độ pha loãng 10-1, ủ ở 30oC, 1 – 7 ngày Cấy canh trường có mốc mọc lên đĩa SDA (Sabouraud Dextrose Agar) , MEA (Malt Extract Agar) hay PDA (Potato Dextrose Agar) , ủ ở 30oC trong 7 ngày. Kết luận: có/không có nấm mốc Phân tích tổng nấm men và nấm mốc Đồng nhất và pha loãng thành các nồng độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3 Trải 0,1ml mẫu lên đĩa DRBC hoặc DG18, ủ ngửa đĩa ở 25oC, 5-7 ngày Trải 0,1ml mẫu lên đĩa MEA hoặc PDA, ủ ngửa đĩa ở 30oC, 7 ngày Đếm khuẩn lạc nấm mốc, nấm men, tính mật độ (CFU/g)