Bài giảng Sinh học phân tử - Sinh tổng hợp protein

SINH TỔNG HỢP PROTEIN ThS. Nguyễn Thanh Tố Nhi KHÁI QUÁT Sinh tổng hợp protein = Dịch mã = Giai đoạn cuối của sự biểu hiện TTDT/mARN thành trình tự acid amin tƣơng ứng/chuỗi polypeptid Xảy ra trong tế bào chất  Ở Prokaryote khác eukaryote (eukaryote phức tạp hơn) CÁC YẾU TỐ CẦN THIẾT Ribosom: bộ máy dịch mã mARN: chứa thông tin quy định trình tự aa cần tổng hợp tARN: vận chuyển aa đến rbs Aminoacyl-tARN sythetase: enzyme gắn aa vào tARN RIBOSOM Cấu tạo? Prokaryote, eukaryote Trạng thái trƣớc khi dịch mã, dịch mã? Ảnh hƣởng Mg2+? Chức năng? RIBOSOM Cấu tạo? Prokaryote, eukaryote Trạng thái trƣớc khi dịch mã, dịch mã? Ảnh hƣởng Mg2+? Chức năng? mARN Vùng mã hóa bắt đầu bằng codon khởi đầu (AUG), kết thúc bằng codon kết thúc (UAA, UAG, UGA) tARN Chất kết nối giữa TTDT đƣợc mã hóa ở mARN với trình tự aa của protein tƣơng ứng Mỗi tARN vận chuyển 1 loại aa Mỗi aa có thể đƣợc vận chuyển bởi một số tARN khác nhau tARN duy nhất: aa liên quan đến 1 tARN tARN đồng nhận: các loại tARN liên quan đến 1 aa Sự dị biệt codon: có 1 vài codon cho 1 aa đƣợc sử dụng tARN Là quá trình gắn amino acid với tARN Xúc tác bởi aminoacyl-tARN synthetase 2 bƣớc: Hoạt hóa aa: aa phản ứng với ATP hình thành aminoacyl adenylate hoạt hóa Gắn aa: enzym aminoacyl-tARN synthetase gắn aa hoạt hóa với tARN tạo phức hợp aminoacyl-tARN Aminoacyl hóa tARN 1) Amino acid + ATP aminoacyl-AMP + PPi 2Pi 2) Aminoacyl-AMP + tARN Aminoacyl-tARN + AMP Aminoacyl hóa tARN Sơ đồ phản ứng Aminoacyl hóa tARN Câu hỏi: 20 loại tARN cho 20 loại aa? 20 loại tARN-aminoacyl synthetase cho 20 loại aa? • Cung cấp sự liên hệ giữa mã di truyền (mARN) và protein (aa), hoạt hóa aa trƣớc khi nối vào protein • Liên kết ester giữa aa & tARN cung cấp năng lƣợng cho việc hình thành liên kết peptid trong dịch mã Aminoacyl hóa tARN Chức năng Aminoacyl hóa tARN Trong quá trình dịch mã, Rbs Không xác định đƣợc tARN có gắn đúng với aa tƣơng ứng hay không Chỉ đảm bảo sự ăn khớp giữa codon/mARN và anticodon/tARN, nếu khớp thì aa/tARN dù đúng hay sai đều đƣợc nối vào chuỗi polypeptid. Aminoacyl hóa tARN “Bƣớc đọc sửa sai” chỉ xảy ra ở giai đoạn aminoacyl hóa bởi enzym aminoacyl-tARN synthetase. Tính chính xác của bƣớc này thể hiện ở việc nhận diện:  Aa qua kích thƣớc, điện tích, cấu dạng  tARN nhờ nhánh D và vòng anticodon tARN VÀ CODON KHỞI ĐẦU Eukaryote • Codon khởi đầu: AUG (~methionin = Met) • Có 2 loại tARN mang Met đến kết hợp với codon AUG/mARN tARNiMet: dùng cho AUG mở đầu chuỗi polypeptid tARNmMet: dùng cho AUG khác nằm trong chuỗi polypeptid Prokaryote Codon khởi đầu: AUG, GUG (formyl-methionin = fMet) 2 loại tARN: tARNfMet: AUG mở đầu chuỗi polypeptid (chuỗi peptid ở Prokar đƣợc khởi đầu = formyl-methione) tARNmMet: dùng cho codon AUG khác trong chuỗi polypeptid tARN VÀ CODON KHỞI ĐẦU Các tARN & codon khởi đầu Vi khuẩn TB nhân thật Codon khởi đầu AUG, GUG AUG tARN mang Met khởi đầu tARNfMet tARNiMet tARN mang Met khác / protein tARNmMet tARNmMet Acid amin khởi đầu chuỗi peptid Formyl-methionin Methionine TIẾN TRÌNH DỊCH MÃ 3 giai đoạn chính: Khởi đầu Nối dài Kết thúc KHỞI ĐẦU DỊCH MÃ Yếu tố cần thiết mARN tARN mang acid amin mở đầu 2 tiểu đơn vị của ribosom Yếu tố khởi đầu Prokaryote: IF1, IF2, IF3 Yếu tố khởi đầu Eukaryote : eIF1, eIF2,, eIF10 3 vị trí quan trọng/rbs P (peptidyl-tARN): chuỗi polypeptid đang hình thành gắn với tARN A (aminocyl): tARN mang 1 aa đến đối mã – codon kế tiếp/mARN chƣa đƣợc dịch mã E (exit) tARN đến vị trí này bị phóng thích RIBOSOM KHỞI ĐẦU CHUỖI PEPTID Ở VI KHUẨN Trình tự Shine-Dalgarno/mARN Giúp ribosom của VK hƣớng tới đúng codon khởi đầu của mARN Là 1 tt ở đầu 5’ chứa polypurin ngắn bổ sung với 1 tt giàu pyrimidin ở đầu 3’ của rARN 16S Nằm gần điểm xuất phát của trình tự mã hóa mARN Sự khởi đầu dịch mã không nhất thiết nằm gần điểm khởi đầu 5’ của mARN Tiến trình khởi đầu gồm các bƣớc: 1. IF3 gắn vào tiểu ĐV nhỏ tại E IF1 gắn vào tiểu ĐV nhỏ tại A. IF2 (GTPase) gắn vào IF1 và chồm qua vị trí P để tiếp xúc với tARNfMet 2. Tiểu ĐV nhỏ của ribosom gắn mARN nhờ bắt cặp base giữa vị trí gắn ribosom (rbs) trên mARN với rARN 16S sao cho codon khởi đầu nằm tại vị trí P. 3. tARNfMet gắn vào tiểu đơn vị nhỏ tại vị trí P nhờ sự trợ giúp của IF2 4. Khi codon khởi đầu + tARNfMet bắt cặp, tiểu ĐV nhỏ thay đổi cấu hình IF3 không gắn đƣợc & bị phóng thích Tiểu ĐV lớn gắn vào TĐV nhỏ 5. Sự gắn TĐV lớn kích hoạt GTPase (IF2) thủy giải GTP thành GDP phóng thích IF2 & IF1 khỏi ribosom giải phóng vị trí A KHỞI ĐẦU Prokaryote Tiến trình khởi đầu 1.TĐV 30S gắn vào mARN (codon khởi đầu AUG/mARN nằm tại vị trí P/rbs nhờ trình tự Shine-Dalgarno) 2. tARNfMet gắn vào phức hợp 1 tại P/rbs 3. TĐV 50S gắn vào phức hợp 2 TĐV 30S – mARN – tARNfMet – TĐV 50S KHỞI ĐẦU Eukaryote Trình tự Kozak: tiểu đơn vị nhỏ 40S của rbs gắn vào đầu 5’ mARN di chuyển để “quét” tìm codon AUG trong 1 “ngữ cảnh” đúng KHỞI ĐẦU Eukaryote 1) Chuẩn bị TĐV 40S eIF1A & eIF3 gắn vào TĐV nhỏ tại A và E eIF1A giúp eIF5B-GTP gắn vào tđv nhỏ eIF5B-GTP giúp phức eIF2-GTP với tARNiMet gắn vào, eIF5B- GTP và eIF2-GTP định vị tARNiMet vào vị trí P/rbs 40S 2) Chuẩn bị mARN eIF4E gắn chóp 5’ của mARN, giúp eIF4A và eIF4G gắn vào mARN, 3 protein này tạo eIF4F hoàn chỉnh eIF4B gắn trực tiếp vào và hoạt hóa hoạt tính helicase trên eIF4F để loại bỏ cấu trúc bậc 2 ở đầu 5’ của mARN KHỞI ĐẦU Eukaryote 3) eIF4F/B giúp tđv nhỏ gắn tARNiMet tiếp xúc với mARN từ chóp 5’ nhờ tƣơng tác eIF4F và eIF3. Tđv nhỏ trƣợt trên mARN theo hƣớng 5’3’ đến khi codon AUG khởi đầu (trong trình tự Kozak) vào đúng vị trí P. Sự trƣợt của mARN phụ thuộc ATP nhờ hoạt tính helicase trong eIF4F 4) Sự bắt cặp chính xác giữa anticodon của tARNiMet và AUG dẫn đến phóng thích eIF2 và eIF3, tạo điều kiện cho tđv lớn gắn vào tđv nhỏ 5) Sự gắn tđv lớn sẽ phóng thích các yếu tố khởi đầu còn lại do kích thích thủy giải GTP nhờ eIF5B tARNiMet đƣợc đặt đúng vị trí P Vị trí A sẵn sàng tiếp nhận các tARN đã hoạt hóa khác cho giai đoạn nối dài KHỞI ĐẦU Eukaryote KHỞI ĐẦU Eukaryote Tiến trình khởi đầu 1.TĐV 40S gắn vào tARNiMet (định vị tARNiMet tại P/rbs) 2. Phức hợp gắn vào mARN (rbs hƣớng vào đúng AUG mở đầu/5’-mARN nhờ trình tự Kozak) 3. TĐV 60S gắn vào phức hợp 2 TĐV 40S – tARNiMet – mARN - TĐV 60S YẾU TỐ KHỞI ĐẦU Prokar Eukar Chức năng IF1 eIF1A Ngăn không cho aminoacyl-tARN thường gắn vào vị trí A IF2 eIF2 Định vị tARNiMet/ tARNfMet vào P/rbs eIF-2 gắn trực tiếp vào tARNiMet IF3 eIF3 Ngăn cản 2 tiểu đơn vị rbs kết hợp thành rbs hoàn chỉnh eIF4 Gắn chóp 5’ vào tháo xoắn cấu trúc bậc 2 tạo điều kiện cho rbs gắn vào eIF5 Giúp phức eIF-2_GTP/ tARNiMet gắn vào rbs Giải phóng các yếu tố khởi đầu khỏi rbs sau khi gắn tiểu đơn vị lớn Hƣớng 5’3’. Tƣơng đối giống giữa prokaryote và eukaryote  Tiến trình nối dài chu kỳ gồm 3 bƣớc, sau mỗi chu kỳ 1 acid amin mới đƣợc thêm vào mạch polypeptid Cần các protein – 3 yếu tố nối dài NỐI DÀI Prokar Eukar Chức năng EF-Tu EF-1α Mang các aminoacyl-tARN tới vị trí A/rbs EF-Ts EF-1βγ Tái hồi EF-Tu hoặc EF-1α EF-G EF-2 Tham gia vào bƣớc chuyển vị của chu kỳ nối dài 1.  Aminoacyl-tRNA có đối mã đúng đƣợc mang vào A nhờ EF-Tu-GTP  GTP GDP, EF- Tu phóng thích aminoacyl- tRNA vào đúng vị trí A NỐI DÀI GTPase 2. Liên kết peptid đƣợc hình thành giữa aminoacyl- tRNA ở A với peptidyl- tRNA ở P nhờ peptidyl transferase (do rARN 23S đảm nhiệm) → chuyển polypeptid đang tổng hợp từ tRNA ở P sang aminoacyl-tRNA ở A NỐI DÀI 3. Peptidyl-tRNA mới hình thành ở A đƣợc chuyển vị sang P nhờ EF-G-GTP: năng lƣợng thủy phân GTP thành GDP để giải phóng vị trí A cho 1 chu kỳ mới 4. EF-G, EF-Tu tái tạo lại GTP để tham gia chu kỳ mới (EF- Tu nhờ EF-Ts) NỐI DÀI Năng lƣợng cho 1 chu kỳ nối dài: 1ATP (aminoacyl hóa tARN) 2GTP : •1 cho EF-Tu để gắn tARN-aa vào A •1 cho EF-G để chuyển peptidyl-tARN từ AP) NỐI DÀI KẾT THÚC DỊCH MÃ Tiến trình nối dài diễn ra đến khi codon kết thúc (UAA, UAG, UGA) đi vào vị trí A Yếu tố kết thúc RF nhận diện codon kết thúc, kích hoạt kết thúc dịch mã, phóng thích chuỗi polypeptid KẾT THÚC DỊCH MÃ Có 2 loại RF Loại I: nhận diện codon stop & thủy phân chuỗi polypeptid khỏi tARN ở vị trí P •Eukaryote: 1 loại RF nhận diện cả 3 codon kết thúc •Prokaryote: 2 loại RF: UAG (RF1), UGA (RF2), UAA (RF1&2) Loại 2: kích thích sự tách yếu tố loại I ra khỏi rbs nhờ năng lƣợng thủy giải GTP •Eukaryote: eRF3, Prokaryote: RF3 Cấu trúc vòng của mARN khi dịch mã Eukaryote Cấu trúc vòng của mARN (5’CAP gắn với polyA) nhờ poly A binding protein (PABP) Rbs sau khi hoàn tất 1 chuỗi peptid quay lại điểm xuất phát khởi đầu chu trình dịch mã mới nhanh chóng KẾT THÚC DỊCH MÃ Sau khi kết thúc dịch mã, rbs vẫn gắn mARN và 2 tARN tại P & E Yếu tố tái sử dụng rbs (RRF) giúp thu hồi bộ máy dịch mã: RRF gắn vào vị trí A, kéo EF-G vào rbs, đẩy tARN ra khỏi rbs RRF và EF-G phóng thích khỏi rbs cùng với mARN TÓM TẮT QUÁ TRÌNH DỊCH MÃ POLYRIBOSOM/POLYSOME Ở Prokar & eukar, khi rbs đầu tiên dịch mã đƣợc 1 đoạn thì các rbs khác gắn vào phía trƣớc rbs đầu tiên trên mARN để dịch mã Do đó, các rbs xếp thành chuỗi trên mARN tạo nên cấu trúc polyribosom (polysom) Khoảng 15 – 20 rbs có thể gắn cùng lúc trên mARN  tốc độ tổng hợp protein tăng đáng kể ở Prokaryote & Eukaryote POLYSOME NHU CẦU NĂNG LƢỢNG CHO DỊCH MÃ Để thực hiện các phản ứng đặc biệt: hoạt hoá aa bằng cách gắn chúng vào tARN Cho 1 quá trình nào đó: tháo xoắn cấu trúc bậc 2 của mARN hoặc cho sự chuyển dịch rbs trong các bƣớc chuyển vị trong quá trình nối dài Duy trì các yếu tố ở trạng thái hoạt tính nhƣ EF - Tu Cho sự biến dạng của ribosom: sau khi gắn kết aa – tARN vào vị trí A NHU CẦU NĂNG LƢỢNG CHO DỊCH MÃ Giai đoạn Prokaryote Eukaryote Aminoacyl hóa ATP ATP Khởi đầu GTP Kết hợp IF-2 GTP Kết hợp eIF-2 ATP Gắn chóp và tháo xoắn Nối dài GTP Kết hợp EF-Tu GTP Kết hợp EF-G GTP Kết hợp EF-Tu GTP Kết hợp EF-G Kết thúc GTP GTP ĐỘ CHÍNH XÁC QUÁ TRÌNH DỊCH MÃ Aminoacyl hóa tARN Tƣơng tác codon – anticodon Kết thúc sớm – muộn AMINOACYL HÓA tARN Aminoacyl hóa sai: tARN có thể nhận 1 aa không đúng Enzym aa – tARN synthetase dùng tARN có anticodon không chuyên biệt cho các aa đƣợc gắn vào nó Một số aa có cấu trúc tƣơng tự với aa cần đƣợc đƣa vào TƢƠNG TÁC CODON - ANTICODON Phức hợp sai giữa codon và anticodon sẽ dẫn đến việc gắn vào aa không đúng. Các nghiên cứu đột biến vi khuẩn cho thấy các protein chuyên biệt trong các tiểu đơn vị của rbs đảm bảo việc gắn đúng các codon và anticodon trong suốt quá trình dịch mã Các sai sót của giai đoạn kết thúc có thể xảy ra do kết thúc sớm (premature termination) hoặc kết thúc muộn do đọc quá. Sự đọc quá do lỗi của bộ máy dịch mã, không nhận ra codon dừng. Tất nhiên, aa đƣợc đƣa vào và dịch mã liên tục qua cả vùng không mã hoá 3’ mARN. Sự đọc quá cũng có thể do một đột biến ở codon đối mã nào đó làm cho codon đối mã này giải mã đƣợc codon kết thúc KẾT THÚC SỚM – KẾT THÚC MUỘN YẾU TỐ ỨC CHẾ DỊCH MÃ YẾU TỐ ỨC CHẾ DỊCH MÃ YẾU TỐ ỨC CHẾ DỊCH MÃ