Bài giảng Nuôi cấy tế bào động vật, kĩ thuật và ứng dụng - Bài 3: Kỹ thuật nuôi cấy sơ cấp tế bào động vật

4/27/20 vbngoc@hcmus.edu.vn 1 Câu hỏi Tại sao? Bạn là chuyên gia và tế bào gốc, bạn tư vấn cho bệnh nhân nên thu mô nào nào trong các mô sau để phân lập được tế bào gốc? Mô dây rốn Mô mỡ Mô tuỷ xương Mô sụn Ông Đại bị bệnh thoái hoá khớp gối cấp độ nặng, các thuốc truyền thống không thể điều trị được. Ông Đại tìm hiểu và thấy ghép tế bào gốc có thể điều trị được căn bệnh này. 4/27/20 vbngoc@hcmus.edu.vn 2 Nuôi cấy tế bào là gì? Lấy tế bào khỏi cơ thể động vật và giúp tế bào tăng trưởng trong môi trường nhân tạo Nuôi cấy sơ cấp 4/27/20 3 Nuôi cấy thứ cấp vbngoc@hcmus.edu.vn KHÁI NIỆM NUÔI CẤY SƠ CẤP • NUÔI CẤY SƠ CẤP (PRIMARY CULTURE) LÀ QUÁ TRÌNH NUÔI TẾ BÀO TRỰC TIẾP TỪ MÔ TRƯỚC LẦN CẤY CHUYỀN ĐẦU TIÊN (SUBCULTURE). • TRONG NUÔI CẤY SƠ CẤP, CÁC TẾ BÀO BAN ĐẦU THƯỜNG LÀ MỘT HỖN HỢP CÁC DÒNG TẾ BÀO KHÁC NHAU, HOẶC CHỨA MỘT KIỂU KẾ BÀO TRỘI NHẤT, TRONG ĐÓ CÓ NHỮNG TẾ BÀO QUAN TÂM VÀ NHỮNG TẾ BÀO KHÁC (ĐƯỢC COI LÀ TẾ BÀO TẠP NHIỄM • SAU ĐÓ, VIỆC NUÔI CẤY ĐƯỢC GỌI LÀ THỨ CẤP (SECONDARY CULTURE) vbngoc@hcmus.edu.vn 4/27/20 4 Thu nhận cơ quan Tế bào thứ cấp Cấy chuyền Cấy chuyền Tế bào sơ cấp Nuôi mô Cắt nhỏ Thành tế bào đơn Tế bào sơ cấp 4/27/20 vbngoc@hcmus.edu.vn 5 Nuôi cấy thứ cấp – Cấy chuyền (or passage, or transfer) từ nuôi cấy sơ cấp • Cấy chuyền = quá trình thu nhận và tái nuôi cấy tế bào sau khi chúng gia tăng số lượng bản sao trong nuôi cấy – Thường chứa kiểu tế bào đơn – Có thể tăng sinh liên tục trong nhiều thế hệ – Có hai kiểu dòng tế bào khi nuôi cấy: • Dòng tế bào • Dòng tế bào liên tục 4/27/20 vbngoc@hcmus.edu.vn 6 Một số khái niệm dòng tế bào 4/27/20 vbngoc@hcmus.edu.vn 7 Dòng tế bào Dòng tế bào liên tục Nuôi cấy sơ cấp-Tế bào sơ cấp Nuôi cấy thứ cấp-Tế bào thứ cấp 4/27/20 vbngoc@hcmus.edu.vn 8 4/27/20 vbngoc@hcmus.edu.vn 9 (Regenerative Medicine, 2006) Tăng sinh 4/27/20 vbngoc@hcmus.edu.vn 10 – Có đời sống hạn định, lão hóa sau một số lần cấy chuyền nhất định (khoảng 30 lần phần chia) – Thường là lưỡng bội và duy trì một số mức độ biệt hóa – Cần thiết để thiết lập một hệ thống ngân hàng TB mẹ (Master bank) và ngân hàng TB làm việc (working bank) để duy trì những dòng này trong thời gian dài vbngoc@hcmus.edu.vn 4/27/20 11 Dòng tế bào Dòng tế bào liên tục (CHO, COS1, hela, Vero: khả năng phân bào vĩnh viễn/dài; không thay đổi đặc tính Chúng thường là những tế bào chuyển dạng (transformation) Tế bào từ khối u. Nhiễm với các viral oncogenes Xử lí hóa chất (chemical treatments). Bất lợi của những dòng này là giữ lại rất ít các đặc tính in vivo. 4/27/20 vbngoc@hcmus.edu.vn 12 Chuyển dạng (Transformation) Và Chuyển nhiễm (Transfection) • Chuyển dạng – Cảm ứng thay đổi kiểu hình ban đầu thông qua sự thay đổi DNA và sự biểu hiện gen • Tốc độ phát triển • Kiểu phát triển (loss of contact inhibition) • Hình thành sản phẩm chuyên biệt • Kéo dài tuổi thọ • Mất khả năng bám dính • Chuyển nhiễm – Đưa DNA vào trong tế bào (like viral DNA) vbngoc@hcmus.edu.vn 4/27/20 13 Thuận lợi Thường giữ được nhiều các đặc tính đã được biệt hóa của tế bào in vivo. Bất lợi: Ban đầu hỗn tạp nhưng sau đó trở nên nổi trội ở các fibroblast Các nuôi cấy sơ cấp thường tốn công sức Có thể duy trì in vitro trong thời gian giới hạn 4/27/20 vbngoc@hcmus.edu.vn 14 Hai kiểu nuôi cấy sơ cấp KIỂU 1: NUÔI CẤY MẢNH MÔ SƠ CẤP Là việc nuôi cấy các mảnh mô in vitro. Trong quá trình nuôi cấy, các tế bào từ mảnh mô sẽ phát triển lan ra từ vùng mô trung tâm. KIỂU 2: NUÔI CẤY SƠ CẤP TẾ BÀO ĐƠN Là việc nuôi cấy các tế bào đơn được tách ra từ mảnh mô. Trong quá trình nuôi, từng mỗi tế bào sẽ phát triển tăng sinh thành nhiều tế bào mới. 4/27/20 15vbngoc@hcmus.edu.vn THU NHẬN MẪU MÔ CẮT NHỎ (chọn lọc mẫu mô quan tâm, cắt bỏ phần mô chết) Cắt nhỏ (mảnh nhỏ để nuôi) Nuôi mẫu mô sơ cấp Thu nhận tế bào mới Thu mảnh mô thứ cấp Tách tế bào bằng cơ học (nghiền, ép) NUÔI SƠ CẤP Cấy chuyền DÒNG TẾ BÀO Tách tế bào bằng enzym (ủ) Trypsin lạnh Trypsin ấm Ly tâm Collagenase Tái huyền phù 4/27/20 vbngoc@hcmus.edu.vn 16 Quy trình nuôi cấy sơ cấp Nuôi cấy Xử lí mẫu Nuôi cấy tế bào đơn: Tách mô thành tế bào đơn Nuôi cấy mảnh mô: Cố định mảnh mô Thu nhận –bảo quản mẫu 4/27/20 17vbngoc@hcmus.edu.vn Thu nhận mẫu • Các mẫu thu nhận có thể bao gồm bất kì mô sống nào của cơ thể. • Phải làm sạch mô tại vị trí lấy mẫu bằng cồn, cho mô vào dung dịch PBS, nhanh chóng chuyển về PTN. • Tùy loại mẫu mô cũng như thời gian cần thiết vận chuyển về phòng thí nghiệm: có kế hoạch vận chuyển chúng trong điều kiện thích hợp. 4/27/20 18vbngoc@hcmus.edu.vn Thu nhận mảnh mô 4/27/20 19vbngoc@hcmus.edu.vn Thu nhận- Bảo quản mẫu 4/27/20 20vbngoc@hcmus.edu.vn Thu nhận - Bảo quản mẫu 4/27/20 21vbngoc@hcmus.edu.vn Xöû lyù sô boä maãu moâ • röûa nhieàu laàn baèng dung dòch PBS coù boå sung khaùng sinh (thöôøng laø gentamicin hay penicillin vaø streptomicin), khaùng naám • caét boû caùc phaàn moâ cheát, phaàn thöøa (nhö môõ) • caét nhoû moâ thaønh töøng maûnh 2-3 mm2. Caùc maãu naøy coù theå ñöôïc söû duïng ñeå – nuoâi (phaùt trieån sô caáp maûnh moâ–primary explant tissue culture), hoaëc – söû duïng ñeå taùch rôøi caùc teá baøo sau ñoù. 4/27/20 vbngoc@hcmus.edu.vn 22 4/27/20 23 Thu nhận - Bảo quản mẫu vbngoc@hcmus.edu.vn Cắt nhuyễn Ép nhuyễn Tách bằng màng lọc Biện pháp tách mô bằng cơ học 4/27/20 24vbngoc@hcmus.edu.vn Xử lý mẫu Phương pháp cắt nhuyễn Sử dụng lực cơ học bẻ gãy các cầu nối liên bào: dùng kéo, dao cắt nhuyễn các mảnh mô. Huyền phù vào dịch PBS, để lắng, thu dịch trong 4/27/20 25 Phöông phaùp naøy cho hieäu quaû khoâng cao, soá löôïng teá baøo ñôn thu nhaän ít, vì vaäy, thöôøng aùp duïng cho nhöõng maãu moâ coù kích thöôùc lôùn vaø khoâng khan hieám. Tuy nhieân, vieäc taùch baèng phöông phaùp cô hoïc luoân cho khaû naêng soáng cuûa teá baøo cao. vbngoc@hcmus.edu.vn Phương pháp ép nhuyễn Ép nhuyễn mô: dùng 2 phiến lame ép chặt mảnh mô để thu tế bào đơn đối với những mô có liên kết yếu. Có thể dùng pittong của syringe 4/27/20 26vbngoc@hcmus.edu.vn Phương pháp tách bằng màng lọc Tách bằng màng lọc tế bào (Cell strainer): kích thước lỗ trên màng từ 70–100 µm, chỉ cho những tế bào đơn có kích thước tương ứng qua màng. 4/27/20 27 Ñaët maãu moâ leân treân maøng loïc, söû duïng pittong cuûa syringe ñeå chaø saùt maïnh maûnh moâ, khi ñoù, nhöõng teá baøo seõ va chaïm vaøo löôùi loïc vaø taùch rôøi. Nhöõng teá baøo ñôn coù ñöôøng kính nhoû hôn loã loïc seõ loït qua. vbngoc@hcmus.edu.vn Tách rời tế bào đơn Tách bằng enzym Trypsin Trypsin ấm Trypsin lạnh Collagenase Papain Elastase 4/27/20 28 Caùc teá baøo ñoäng vaät trong khoái moâ lieân keát chaët cheõ vôùi nhau vaø vôùi ECM nhôø caùc caáu noái protein hình thaønh giöõa caùc teá baøo vôùi nhau. Ñeå taùch rôøi caùc teá baøo trong khoái moâ, ngöôøi ta thöôøng duøng caùc enzyme protease nhö trypsin, pronase vbngoc@hcmus.edu.vn Quy trình trypsin ấm 4/27/20 29vbngoc@hcmus.edu.vn Quy trình trypsin lạnh Cắt mẫu mô [2 – 3mm], rửa nhiều lần với PBS vô trùng Thay PBS bằng trypsin 0.25% Ủ trong 40C, 6- 18 giờ Loại bỏ trypsin ủ ống chứa mẫu mô trong 36,50C, 20 – 30 phút Thêm môi trường, sục nhẹ nhành cho đến khi mô rời ra Nếu các mảnh mô chưa rời ra có thể thêm môi trường để dễ huyền phù hoặc dùng màng lọc Thu dịch huyền phù tế bào, xác định mật độ, tiến hành nuôi 4/27/20 30vbngoc@hcmus.edu.vn Tách bằng enzyme Trypsin: Chymotrypsin Collagenase Papain Elastase • pH6-9, tối ưu 8-9 • Nồng độ dùng: 0,01%- 0,5% • Ca2+ được xem như chất bảo vệ Trypsin • Bị kìm hãm bởi FBS hoặc Di-Isopropyl- Fluorophosphat(DFP) • Không đặc hiệu cho loại protein: Cắt liên kết –COOH của lysin/arginin và –NH2 à có thể gây hư hai cho tế bào • pH 7-9, thích hợp 8-9 • Cắt liên kết peptide tạo bởi – COOH acid amin thơm với –NH2 • Tính đặc hiệu kém hơn trypsin • Bị ức chế bởi DFB • • Hoạt động tốt: pH7-8, < 450C • Cắt liên kết peptide dạng poly-L prolin; gồm 4 loại đặc trưng tắt từng loại mô chuyên biệtè ít làm hư hại tế bào • pH 4,5- 8,5 • Bị kìm hãm bởi chất oxy hoá • Phân huỷ elastin • Sử dụng kết hợp với enzyme khác 4/27/20 31vbngoc@hcmus.edu.vn 4/27/20 vbngoc@hcmus.edu.vn 32 Hạn chế tối đa thời gian tiếp xúc của enzyme với tế bào Chọn nồng độ tối thiểu enzyme phân tách tuỳ loại tế bào Sử dụng các chất ức chế hoạt tính enzym ngay sau khi phân tách (FBS, protease inhibitor) Tách tế bào bằng phương pháp khác vbngoc@hcmus.edu.vn 4/27/20 33 Phương pháp ly tâm theo gradient tỉ trọng Phương pháp tách tế bào dựa vào marker bề mặt Phương pháp ly tâm theo gradient tỉ trọng 4/27/20 34vbngoc@hcmus.edu.vn 4/27/20 35vbngoc@hcmus.edu.vn 4/27/20 36vbngoc@hcmus.edu.vn Phöông phaùp taùch teá baøo döïa vaøo marker beà maët: -Bao phuû beà maët moãi teá baøo trong cô theå laø nhöõng protein ñaëc bieät goïi laø receptor. -Receptor coù khaû naêng lieân keát hay ñính moät caùch ñaëc hieäu vôùi nhöõng phaân töû tín hieäu. -Coù raát nhieàu receptor, chuùng khaùc nhau ôû caáu truùc vaø aùi löïc vôùi nhöõng phaân töû tín hieäu. -Bình thöôøng, teá baøo söû duïng nhöõng receptor vaø nhöõng phaân töû tín hieäu nhö laø caùch ñeå truyeàn ñaït thoâng tin vôùi nhöõng teá baøo khaùc, vaø tieán haønh nhöõng chöùc naêng rieâng cuûa chuùng trong cô theå. -Trong phöông phaùp naøy, nhöõng receptor beà maët teá baøo ñoùng vai troø laø marker cuûa noù. 4/27/20 vbngoc@hcmus.edu.vn 37 Phương pháp tách tế bào dựa vào marker bề mặt tế bào 4/27/20 38vbngoc@hcmus.edu.vn Nuôi cấy mảnh mô Đặt mảnh mô vào dụng cụ nuôi Mảnh mô nổi Cố định mảnh mô Mảnh mô sống Thành công 4/27/20 39vbngoc@hcmus.edu.vn Phương pháp cố định mảnh mô vbngoc@hcmus.edu.vn 4/27/20 40 Lammel Huyết thanh Tăng kết dính và lật ngược bình nuôi 4/27/20 41vbngoc@hcmus.edu.vn NUÔI CẤY MẢNH MÔ SƠ CẤP (mảnh mô ung thư vú) 4/27/20 42vbngoc@hcmus.edu.vn Nuôi cấy (1)ủ trong tủ nuôi cấy, 370C (2) Thay môi trường mới sau một thời gian tùy loại tế bào (1) Ly tâm thu tế bào đơn (2) Tái huyền phù trong môi trường nuôi (3) Cho vào bình nuôi cấy Sau khi cố định mảnh mô, bổ sung môi trường nuôi cấy 4/27/20 43vbngoc@hcmus.edu.vn Thu nhận mô dạng lỏng – thu nhận tế bào đơn nhân tủy xương chuột 4/27/20 44vbngoc@hcmus.edu.vn 4/27/20 45 TẾ BÀO ĐƠN NHÂN TUỶ XƯƠNG TẾ BÀO ĐÃ QUA NUÔI CẤY vbngoc@hcmus.edu.vn Thu nhận mô dạng lỏng – thu nhận tế bào đơn nhân tủy xương chuột NUÔI CẤY SƠ CẤP HUYỀN PHÙ TẾ BÀO ĐƠN 4/27/20 46vbngoc@hcmus.edu.vn Quan sát tế bào Sự đổi màu môi trường nuôi tế bào Kính hiển vi - Đánh giá sức khoẻ tế bào - Hình thái tế bào - Định danh tế bào - .. 4/27/20 47vbngoc@hcmus.edu.vn 4/15/21 TS. Vũ Bích Ngọc-ngocvu@sci.edu.vn 48