Bài giảng Nuôi cấy tế bào động vật, kĩ thuật và ứng dụng - Bài 1: Giới thiệu về kĩ thuật nuôi cấy tế bào động vật

9/24/18 TS. Vũ Bích Ngọc-vbngoc@hcmus.edu.vn 1 STT Ngày NỘI DUNG 1 10/9 Bài 1. Giới thiệu về kĩ thuật nuôi cấy tế bào động vật (TS. Vũ Bích Ngọc) 2 17/9 Bài 2. Sinh học tế bào nuôi cấy (TS. Vũ Bích Ngọc) 3 24/9 Bài 3. Kĩ thuật nuôi cấy sơ cấp (TS. Vũ Bích Ngọc) 4 1/10 Bài 4. Kĩ thuật cấy chuyền và tạo dòng (ThS. Trương Châu Nhật ) 5 8/10 Bải 5. Kĩ thuật bảo quản tế bào (Cô. Lê Thị Ngân Hà) 6 15/10 Bài 6. Kỹ thuật nhận diện tế bào (ThS. Phan Lữ Chính Nhân) 7 22/10 Bài 7. Kĩ thuật phân tách tế bào (ThS. Phan Lữ Chính Nhân) 8 29/10 Bài 8. Kĩ thuật sản xuất kháng thể đơn dòng (ThS. Lê Thị Hạnh ) 9 5/11 Bài 9. Kĩ thuật biến đổi gen trên tế bào (ThS. Đào Thị Thanh Thuỷ) 10 12/11 Bài 10. Ứng dụng của kĩ thuật nuôi cấy tế bào trong y học và nông nghiệp- Ôn tập (TS. Vũ Bích Ngọc) 9/24/18 TS. Vũ Bích Ngọc-vbngoc@hcmus.edu.vn 2 • thi giữa kì (40%): trắc nghiệm • thi cuối kì (60%): Trắc nghiệm 9/24/18 TS. Vũ Bích Ngọc-vbngoc@hcmus.edu.vn 3 Mục tiêu môn học • Sau khi học xong môn học này, sinh viên: – Hiểu được cấu trúc và chức năng và đặc tính của tế bào – Hiểu được các vấn đề liên quan đến nuôi cấy tế bào động vật, công nghệ tế bào gốc như kỹ thuật, quy trình, các yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến tế bào trước, trong và sau quá trình phân lập, nuôi cấy, tăng sinh, bảo quản, định danh, phân tách tế bào – Liên hệ được các kiến thức về công nghệ nuôi cấy tế bào sự phát triển của lĩnh vực chăn nuôi và y học 9/24/18 TS. Vũ Bích Ngọc-vbngoc@hcmus.edu.vn 4 PTN Sinh học của tế bào động vật Kỹ thuật nuôi cấy tế bào Một số kỹ thuật liên quan Ứng dụng của tế bào động vật 9/24/18 TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn PHÒNG THÍ NGHIỆM NGUYÊN TẮC VÀ TIÊU CHUẨN NHÀ XƯỞNG THIẾT BỊ DỤNG CỤ ĐIỀU KIỆN LÝ-HOÁ TRONG KTNC MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY TBĐV 9/24/18 TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn Nguyên tắc • Phải là phòng sạch (clean room, sterile room), vệ sinh tốt • Phải đảm bảo an toàn cho người làm việc, tránh lây nhiễm bệnh tật. • Phải đảm bảo tinh sạch cho các mẫu vật, hóa chất hữu cơ. • Phải đảm bảo tính chính xác các kết quả thí nghiệm. 9/24/18 TS. Vũ Bích Ngọc-vbngoc@hcmus.edu.vn 7 Một số tiêu chuẩn của một phòng thí nghiệm sạch (1) Ap lực trong phòng cao hơn bên ngoài không khí. (2) Độ vô trùng (có 5 cấp bậc 1, 2, 3, 4, 5 - tương ứng với các mức độ vô khuẩn từ 99; 99,9; 99,99; 99,999; 99,9999%). (3) Độ ẩm (30-45%), hạn chế tối đa đưa nước vào phòng. (4) Độ rung. (5) Độ sạch bụi. (6) Nhiệt độ (điều khiển được). (7) Luồng không khí lưu thông (400m3/giờ). (8) Độ sáng. (9) Mật độ nhân sự làm việc có giới hạn. (10) Không gian hợp lý. (11) Có đủ hệ thống xử lý vệ sinh, hệ thống an toàn. 9/24/18 TS. Vũ Bích Ngọc-vbngoc@hcmus.edu.vn 8 Khu vực phòng đệm Khu vực hành lang Khu vực sản xuất tế bào Panel và hệ thống khí Lối đi Autoclave THIẾT BỊ Kính hiển vi Tủ ATSH Máy li tâm góc Máy li tâm văng Water bath TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn Máy pH 9/24/18 Cân phân tích Máy đo ASTT Máy khuấy từ THIẾT BỊ TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn9/24/18 THIẾT BỊ pipet bán tự động TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn 9/24/18 THIẾT BỊ Dụng cụ nuôi cấy Đĩa 35-60-100mm, bình Flask, đĩa nhiều giếng (4-6-24 giếng), bình quay, spinner Ống ly tâm, pipette 9/24/18 TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn Dụng cụ thủy tinh • Becher • Chai trung tính • Cá khuấy từ • Pipette thủy tinh 9/24/18 TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn Một số dụng cụ thủy tinh Bercher Erlen Bình định mức Lam và lamelle 9/24/18 TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn Pipet 9/24/18 Chỉ tiêu Điều kiện Nhiệt độ Hầu hêt là 370C (ĐV có vú, người; trừ tinh trùng-330C); 38,50C (chim); 25-280C (côn trùng) >20C so với điều kiện tối ưu từng loại TB Có thể chịu đến -1960C; Sử dụng tủ ấm (incubator) trong nuôi in vitro pH Duy trì cân bằng Ion, chức năng enzym nội bào, gắn kết hormone với GF lên receptor Có thể làm thay đổi chuyển hoá tế bào gây apoptosis, sản xuất protein shock nhiệt Ngưỡng: 6,5-7,8, thường được điều chỉnh 7-7,4 Áp suất thẩm thấu Tác nhân chính: muối, glucose Tác động đến sự tăng trưởng và chức năng tế bào Thích hợp 290-310 mOsm Các loại khí CO2 (5%-10%), O2, N2 Điều kiện Lý - Hoá 9/24/18 TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn Môi trường nuôi cấy TBĐV 9/24/18 TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn Thành phần môi trường Thành phần Vai trò Muối vô cơ Cân bằng ASTT, điều hoà điện thế màng Cần trong nền chất tế bào (bám gắn và hoạt độngnhư cofactor Hệ đệm Bicarbonat/phosphat/hepes Carbonhydrate Glucose, galactose, maltose, fructose (1-4,5 g/l) Vitamin Cơ chất cho nhiều cofactor Thường là riboflavin,thiamin, biotin Protein và peptide Albumin, transferrin, fibronectin, fetuin Acid béo và lipid Dạng: cholesterol và steroid Cần trong môi trường không huyết thanh Yêu tố vi lượng Kẽm, đồng, selenium, tricarrboxylic acid trung gian Huyết thành Cung cấp chất dinh dưỡng, GF, chống oxy hoá, cải thiện tính dính của tế bào 9/24/18 TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn SINH HỌC CỦA TBĐV Đặc điểm của tế bào động vật Một số khái niệm dòng tế bào Các cấp độ nuôi cấy mô và tế bào động vật 9/24/18 TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn 28 Chu kì tế bào M Mitosis G1 Gap1 G2 Gap2 G0 S Synthesis G1 check point • cell big • environment suitable G2 check point • DNA replicated • cell big • environment suitable Metaphase check point • chromosome align on spindle ĐẶC ĐIỂM CỦA TẾ BÀO ĐỘNG VẬT 29 Chu kì tế bào • Interphase: – Nhìn chung kéo dài từ 12-14 giờ trong mô động vật có vú – Tế bào đang tổng hợp RNA,tạo protein và phát triển về kích thước • Gap 0 (G0): tế bào thoát ra khỏi chu kì tế bào và không phân chia • Gap 1 (G1): tế bào gia tăng kích thước, tổng hợp RNA và protein, có 1 G1 Checkpoint • S Phase: sự nhân đôi DNA xảy ra • Gap 2 (G2): tế bào sẽ tiếp tục phát triển và sản xuất các protein mới. Có 1 G2 Checkpoint • Mitosis hay M Phase: – Sự phát triển và tổng hợp protein ngừng – Tế bào chia thành 2 tế bào giống nhau. – Mitosis thường xảy ra từ 1-2 giờ – Có Checkpoint trong giữa kì của Mitosis (Metaphase Checkpoint) để đảm bảo tế bào hoàn thành xong sự phân chia. ĐẶC ĐIỂM CỦA TẾ BÀO ĐỘNG VẬT 30 SỰ TĂNG SINH IN VITRO • Sự TĂNG SINH của tế bào trong nuôi cấy phụ thuộc: – Trạng thái tự nhiên của tế bào: • Vai trò của bộ gen – Giới hạn Hayflick • Vai trò của sự biểu hiện gen – Môi trường nuôi cấy • Cơ chất tế bào bám • Thành sinh lí và sinh hoá của môi trường nuôi • Thành phần của phase khí • Nhiệt độ nuôi • Tương tác tế bào-tế bào và tế bào-chất nền ĐẶC ĐIỂM CỦA TẾ BÀO ĐỘNG VẬT ĐẶC ĐIỂM CỦA TẾ BÀO ĐỘNG VẬT Tính cơ học yếu (dễ vỡ) Tăng trưởng, phân chia chậm (20-40 giờ) Hiệu suất sinh chất có hoạt tính sinh học thấp9/24/18 TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn ĐẶC ĐIỂM CỦA TẾ BÀO ĐỘNG VẬT Dung hợp, biến nạp, tải nạp tế bàoà Thay đổi kiểu gen và kiểu hình Tính chất cần giá đỡ -TB bám vào giá đỡ để có thể sống sót, phân chia - Ngoại trừ: hồng cầu, TB ung thư, 1 số dòng TB liên tục 9/24/18 TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn ĐẶC ĐIỂM CỦA TẾ BÀO ĐỘNG VẬT Tính cơ học yếu Tăng trưởng và phân chia chậm Cơ chế kìm hãm ngược Tính chất cần giá đỡ Thay đổi kiểu gen và kiểu hình Có thể được bảo quản lâu dài bằng phương pháp lạnh sâu ..9/24/18 TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn • Dòng tế bào • Dòng tế bào liên tục • Dòng tế bào tạm thời • Tế bào sơ cấp • Tế bào thứ cấp Một số khái niệm dòng tế bào 9/24/18 TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn 9/24/18 TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn 9/24/18 TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn (Regenerative Medicine, 2006) Tăng sinh 9/24/18 TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn Thu nhận cơ quan Tế bào thứ cấp Cấy chuyền Cấy chuyền Tế bào sơ cấp Nuôi mô Cắt nhỏ Thành tế bào đơn Tế bào sơ cấp 9/24/18 TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn 39 Các kiểu nuôi cấy tế bàoàLoại tế bào 1. Nuôi cấy sơ cấp (Primary Culture) – Thu nhận trực tiếp từ các mô và nuôi cấy theo kiểu như • Sự phát triển ra của các mô trong nuôi cấy • Tách thành tế bào đơn (bằng enzyme hay cơ học) – Thuận lợi: • Thường giữ được nhiều các đặc tính đã được biệt hóa của tế bào in vivo. – Bất lợi: • Ban đầu hỗn tạp nhưng sau đó trở nên nổi trội ở các fibroblast • Các nuôi cấy sơ cấp thường tốn công sức • Có thể duy trì in vitro trong thời gian giới hạn 40 2. Nuôi cấy thứ cấp – Cấy chuyền (or passage, or transfer) từ nuôi cấy sơ cấp • Cấy chuyền = quá trình thu nhận và tái nuôi cấy tế bào sau khi chúng gia tăng số lượng bản sao trong nuôi cấy – Thường chứa kiểu êế bào đơn – Có thể tăng sinh liên tục trong nhiều thế hệ – Có hai kiểu dòng tế bào khi nuôi cấy: • Dòng tế bào • Dòng tế bào liên tục Các kiểu nuôi cấy tế bào 41 1) Dòng tế bào • Có đời sống hạn định, lão hóa sau một số âần cấy chuyền nhất định (chừng 30 lần phần chia) • Thường là lưỡng bội và duy trì một số mức độ biệt hóa • Cần thiết để thiết lập một hệ thống ngân hàng Master và ngân hàng làm việc để duy trì những dòng này trong thời gian dài Các kiểu nuôi cấy tế bào Dòng tế bào liên tục (CHO, Schneider-2, COS1, hela. Vero: khả năng phân bào vĩnh viễn/dài; không thay đổi đặc tính 9/24/18 TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn 43 2) Dòng tế bào liên tục • Có thể tăng sinh không hạn định • Chúng thường là những tế bào chuyển dạng: – Tế bào từ khối u. – Nhiễm với các viral oncogenes – Xử lí hóa chất (chemical treatments). • Bất lợi của những dòng này là giữ lại rất ít các đặc tính in vivo. 44 Chuyển dạng (Transformation) Và Chuyển nhiễm (Transfection) • Chuyển dạng – Cảm ứng thay đổi kiểu hình ban đầu thông qua ưự thay đổi DNA và sự biểu hiện gen • Tốc độ phát triển • Kiểu phát triển (loss of contact inhibition) • Hình thành sản phẩm chuyên biệt • Kéo dài tuổi thọ • Mất khả năng bám dính • Chuyển nhiễm – Đưa DNA vào trong tế bào (like viral DNA) *9/24/18 TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn 46 Tại sao cần nuôi cấy mô/tế bào? • Nghiên cứu – Vượt qua các vấn đề trong nghiên cứu như: • Các tác động của các mô xung quanh • Các biến đổi mà do các điều kiện của động vật – Giảm các động vật sử dụng • Sản xuất các sản phẩm thương mại – vaccine, antibody, hormone – Tế bào sử dụng cho cấy ghép NUÔI TẾ BÀO SƠ CẤP NUÔI CẤY PHÁT TRIỂN MẢNH MÔ SƠ CẤP CẤY CHUYỀN * 9/24/18 TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn THU NHẬN MẪU MÔ CẮT NHỎ (chọn lọc mẫu mô quan tâm, cắt bỏ phần mô chết) Cắt nhỏ (mảnh nhỏ để nuôi) Nuôi mẫu mô sơ cấp Thu nhận tế bào mới Thu mảnh mô thứ cấp Tách tế bào bằng cơ học (nghiền, ép) NUÔI SƠ CẤP Cấy chuyền DÒNG TẾ BÀO Tách tế bào bằng enzym (ủ) Trypsin lạnh Trypsin ấm Ly tâm Collagenase Tái huyền phù 9/24/18 TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn Thu nhận cơ quan Cell line Cấy chuyền Cấy chuyền Nuôi sơ cấp Nuôi mô Cắt nhỏ Thành tế bào đơn Nuôi sơ cấp 9/24/18 TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn Tách tế bào bằng phương pháp khác Ly tâm đẳng tỷ trọng Dựa vào marker bề mặt 9/24/18 TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn TẠO DÒNG TẾ BÀO KỸ THUẬT CHỌN DÒNG TẾ BÀO CÁC PHƯƠNG PHÁP XÂY DỰNG ĐƯỜNG CONG TĂNG TRƯỞNG VÀ ĐO SỰ PHÁT TRIỂN 9/24/18 TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY TẾ BÀO MÔI TRƯỜNG HUYẾT THANH MÔI TRƯỜNG KHÔNG HUYẾT THANH Cung cấp hormone và GF cần thiết cho chức năng tế bào Bổ sung hormone, GF Cung cấp các nhân tố bám dính (fibronectin, vitronectin) Phủ đĩa với các nhân tố bám dính hay polylysine Hoạt động như một đệm pH Sử dụng các hệ đệm hữu cơ Gắn, bất hoạt hay tách ra các chất độc (hợp chất hữu cơ gắn kim loại) Sử dụng nước tinh sạch, chuẩn bị môi trường tươi, bổ sung albumine Chứa các protein bám làm ổn định và/hay giúp vận chuyển các hormone, chất dinh dưỡng và tế bào Bổ sung các protein bám như transferrin, eruloplasm Cung cấp các chất dinh dưỡng Sử dụng các môi trường phức tạp Chứa các chất ức chế protease Sử dụng chất ức chế trypsin khi cấy chuyền và thêm các chất ức chế protease thích hợp Chứa các nhân tố biệt hoá Bổ sung hay không, để điều hoà sự phát triển tế bào và biệt hoá Chứa các nhân tố gây sự lão hoá trong các tế bào chuột bình thường Không có tác dụng lên sự già yếu tế bào, các tế bào phát triển liên tục9/24/18 TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn MỘT SỐ KỸ THUẬT LIÊN QUAN KỸ THUẬT VÔ TRÙNG QUAN SÁT TẾ BÀO KIỂM SOÁT NHIỄM ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO 9/24/18 TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn – Khử trùng bằng nhiệt ẩm (nồi autoclave) • Áp suất autoclave và nhiệt độ • 5 psi 1070C • 7 psi 1100C • 10 psi 1150C • 15 psi 1210C • 20 psi 1260C – Khử trùng bằng nhiệt khô • Nhiệt độ và thời gian khử trùng • 1200C 8 giờ • 1400C 3 giờ • 1600C 1 giờ • 1800C 20 phút ¤ Khử trùng bằng hoá chất: ethanol 70%; formaldehyde ¤ Một số phương pháp vô trùng thường dùng khác Ø Chiếu tia UV: sử dụng cho tủ thao tác hoặc phòng thao tác Ø Chiếu tia Gamma: dùng để vô trùng các dụng cụ nhựa Ø Lọc vô trùng: sử dụng phin lọc với đường kính lỗ lớn nhất là 1 nm, thường dùng cho các môi trường hoặc chất lỏng dễ bị biến tính ở nhiệt độ cao TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn Kỹ thuật vô trùng 9/24/18 Quan sát tế bào Sự đổi màu môi trường nuôi tế bào Kính hiên vi - Đánh giá sức khoẻ tế bào - Hình thái tế bào - Định danh tế bào - .. 9/24/18 TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn Phát hiện nhiễm Ngăn ngừa nhiễm Nguồn: nấm, vi khuẩn, mycoplasma, virus, tế bào Nhận biết: độ acid bất thường, môi trường đục, xuất hiện quả cầu, dây, quan sát dưới KHV, nhuộm huỳnh quang, kháng thể, phân tích PCR Vệ sinh dụng cụ, khu vực thao tác Thao tác độc lập trên mỗi dòng tế bào Loại bỏ nhiễm: - bỏ vật dụng/mẫu đã bị nhiễm - Dùng kháng sinh/nấm - Tái thiết lập bằng PP pha loãng tới hạn - Ly tâm percoll (nấm mốc/men) Kiểm soát nhiễm Mycoplasma Nấm Vi khuẩn 9/24/18 TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn Đông lạnh Giải đông Giữ tế bào ở trạng thái ngủ (Lưu trữ tế bào sống trong thời gian dài) Đưa tế bào về trạng thái sinh lý bình thường (hoạt hoá tế bào) Cần có chất bảo quản đông lạnh (DMSO, glycerol, PEG, trehalo, dextro) Cần có môi trường dinh dưỡng Nên đông lạnh chậm: T0 mát (2-80C) à âm (- 15- -800C)à âm sâu (-1960C) Nên giải đông nhanh (370C) Đông lạnh – giải đông tế bào 9/24/18 TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn Ứ N G D Ụ N G C Ủ A K Ỹ T H U Ậ T N CT B Đ V MÔ HÌNH THỬ NGHIỆM VÀ CHẨN ĐOÁN BỆNH SẢN XUẤT CÁC HỢP CHẤT SINH HỌC CÁC TẾ BÀO ĐỘNG VẬT LÀM NGUYÊN LIỆU CẤY GHÉP TẠO CƠ QUAN TỪ TBĐV SẢN XUẤT CÁC VIRUS DIỆT CÔN TRÙNG 9/24/18 TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn Mô hình thử nghiệm – chẩn đoán bệnh Thử nghiệm chất kháng ung thư 9/24/18 TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn Công nghiệp thẩm mỹ Mô hình thử nghiệm – chẩn đoán bệnh 9/24/18 TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn Sinh học tế bào Chẩn đoán tiền sinh Mô hình thử nghiệm – chẩn đoán bệnh 9/24/18 TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn Sản xuất các hợp chất sinh học - Vaccin virus - Interferone - Kháng thể đơn dòng - Hoạt chất sinh học (nhân tố chống đông máu, hoạt hoá plasminogen) 9/24/18 TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn Cấy ghép tế bào – cơ quan Tạo cơ quan từ tế bào động vật nuôi cấy Tế bào làm vật liệu cấy ghép 9/24/18 TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn 9/24/18 TS. Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn