Ảnh hưởng của điều kiện lên men đến khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh của hai chủng xạ khuẩn K4 và HT28 phân lập từ đất Thái Nguyên

Vi Thị Đoan Chính và cs Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 73(11): 115 - 119 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên | 115 ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN LÊN MEN ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP CHẤT KHÁNG SINH CỦA HAI CHỦNG XẠ KHUẨN K4 và HT 28 PHÂN LẬP TỪ ĐẤT THÁI NGUYÊN Vi Thị Đoan Chính*, Dương Thị Tình, Trịnh Ngọc Hoàng Trường Đại học Khoa học - ĐH Thái Nguyên TÓM TẮT Chúng tôi sử dụng phƣơng pháp thực nghiệm để nghiên cứu hai chủng xạ khuẩn K4 và HT 28 phân lập từ đất Thái Nguyên. Hai chủng này có hoạt tính kháng sinh (HTKS) cao, đặc biệt là có khả năng kháng đƣợc một số chủng Pseudomonas aeruginosa gây bệnh trên ngƣời. Chúng tôi đã xác định đƣợc một số điều kiện lên men thích hợp cho sinh tổng hợp CKS của 2 chủng này: chủng K4 lên men thích hợp trong môi trƣờng (MT) A-4H có pH ban đầu = 7, nguồn cacbon thích hợp là glucose và tinh bột, nguồn nitơ thích hợp là bột đậu tƣơng và cao nấm men. Chủng HT 28 lên men thích hợp trong MT Gause 1 có pH ban đầu = 7, nguồn cacbon thích hợp là glucose và lactose, nguồn nitơ thích hợp là muối (NH4)2SO4 và cao nấm men. Từ khoá: xạ khuẩn, điều kiện lên men, hoạt tính kháng sinh, nguồn cacbon, nguồn nitơ ĐẶT VẤN ĐỀ Chất kháng sinh (CKS) là một nhóm thuốc thiết yếu dùng trong y học. Đối với các nƣớc nghèo, thuốc kháng sinh (KS) giữ một vị trí đặc biệt quan trọng. Nhờ có thuốc kháng sinh, nhiều loại bệnh tật, nhất là các bệnh nhiễm khuẩn đã bị đẩy lùi. Tuy nhiên, ngày nay do việc sử dụng thuốc KS không hợp lí đã làm xuất hiện ngày càng nhiều các chủng vi sinh vật gây bệnh kháng thuốc. Pseudomonas aeruginosa cũng là 1 trong số 5 vi khuẩn đứng đầu có khả kháng thuốc [7]. Đứng trƣớc thực trạng nhƣ vậy, một yêu cầu cấp thiết đặt ra hiện nay là tìm ra các chất KS mới để phục vụ cho nhu cầu điều trị các bệnh nhiễm khuẩn và cũng là để bổ sung vào kho thuốc KS dự phòng đang ngày càng thiếu hụt. Trong số các vi sinh vật có khả năng sinh chất KS, xạ khuẩn là nhóm có nhiều tiềm năng nhất, chiếm 80% các chất KS đã đƣợc mô tả. Đây là nguồn tài nguyên quý và đầy triển vọng để phát hiện và tìm kiếm ra các chất KS mới. Trong bài báo này, chúng tôi thông báo kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp chất KS của 2 chủng xạ khuẩn K4 và HT28 – là 2 chủng xạ khuẩn có HTKS cao đã đƣợc tuyển chọn trong số các chủng xạ khuẩn phân lập từ đất  Tel: 0987123606 Thái Nguyên, để từ đó xác định đƣợc điều kiện lên men thích hợp nhất cho quá trình sinh tổng hợp KS của 2 chủng nghiên cứu. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu Xạ khuẩn: 2 chủng xạ khuẩn K4 và HT 28 có HTKS cao, có hoạt phổ rộng, kháng đƣợc cả 2 nhóm vi khuẩn Gram dƣơng và Gram âm, đặc biệt là có hoạt tính kháng đƣợc một số chủng Pseudomonas aeruginosa gây bệnh. Các chủng xạ khuẩn này đƣợc phân lập từ đất Thái Nguyên, đƣợc giữ và bảo quản trong môi trƣờng Gause 1. Vi sinh vật kiểm định là 3 chủng Pseudomonas aeruginosa do Khoa Vi sinh vật- Bệnh viện ĐKTƢ Thái Nguyên cung cấp. Các chủng này phân lập từ bệnh nhân bị nhiễm trùng, đƣợc giữ giống và bảo quản trong môi trƣờng MPA. Phương pháp - Xác định HTKS theo phƣơng pháp khối thạch (để sơ tuyển xạ khuẩn), phƣơng pháp đục lỗ (để xác định HTKS trong dịch thể). - Lựa chọn môi trường (MT) lên men thích hợp: Lên men xạ khuẩn trong các MT cơ bản trên máy lắc tròn với tốc độ 220 vòng/phút ở 28 oC. Sau 120 giờ, xác định HTKS của dịch lên men theo phƣơng pháp đục lỗ. Vi Thị Đoan Chính và cs Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 73(11): 115 - 119 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên | 116 - Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon: Lên men xạ khuẩn trong dung dịch muối A có bổ sung (NH4)2SO4 0,2% và các nguồn cacbon khác nhau. Sau 120 giờ nuôi lắc, xác định HTKS của dịch lên men theo phƣơng pháp đục lỗ. - Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn nitơ: Lên men xạ khuẩn trong dung dịch muối A có bổ sung glucose 1,5% và các nguồn nitơ khác nhau. Sau 120 giờ nuôi lắc, xác định HTKS của dịch lên men theo phƣơng pháp đục lỗ. - Nghiên cứu ảnh hưởng của pH ban đầu: Lên men xạ khuẩn trong môi trƣờng thích hợp đã điều chỉnh pH về các mức 5, 6, 7, 8, 9. Sau 120 giờ nuôi lắc, xác định HTKS của dịch lên men theo phƣơng pháp đục lỗ. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Lựa chọn môi trường lên men thích hợp MT lên men đóng vai trò rất quan trọng trong công nghệ sản xuất CKS. Một MT lên men tốt phải vừa thích hợp cho chủng xạ khuẩn sinh trƣởng tốt lại đồng thời cho hiệu suất sinh KS cao. Để lựa chọn đƣợc MT lên men đáp ứng đƣợc cả 2 điều kiện trên, chúng tôi tiến hành lên men xạ khuẩn trong 4 MT lên men cơ sở và xác định HTKS của dịch lên men. Kết quả đƣợc thể hiện trên bảng 1 và hình 1 cho thấy: Chủng K4 đều có HTKS trong cả 4 môi trƣờng lên men cơ bản, nhƣng HTKS biểu hiện mạnh nhất trong 2 môi trƣờng A-4H và A-4. Chủng HT 28 chỉ có HTKS ở trong 2 môi trƣờng Gause 1 và Gause 2, còn trong 2 môi trƣờng A-4H và A-4, mặc dù đó là nhừng môi trƣờng rất giàu dinh dƣỡng nhƣng lại không có HTKS. Các kết quả này của chúng tôi cũng hoàn toàn phù hợp với một số kết quả đã công bố trƣớc đây, khi nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp CKS của một số chủng xạ khuẩn khác nhau [4], [6]. Nhƣ vậy, trong 4 môi trƣờng lên men đã đƣợc sử dụng, MT A – 4H tỏ ra thích hợp hơn với chủng K4, còn MT Gause 1 lại thích hợp hơn với chủng HT 28. Dịch lên men của các MT này có HTKS mạnh nhất đƣợc thể hiện bằng đƣờng kính của vòng vô khuẩn (VVK) là lớn nhất (hình 2). Căn cứ từ kết quả này, chúng tôi sử dụng 2 MT trên cho các thí nghiệm tiếp theo. Hình 1. Ảnh hƣởng của MT lên men đến HTKS của 2 chủng K4 và HT 28 Bảng 1. HTKS của 2 chủng K4 và HT 28 trên các MT lên men khác nhau TT MT lên men Hoạt tính kháng sinh (D – d, mm) Chủng K4 Chủng HT 28 1 A - 4H 23,6 ± 0,9 0 2 A - 4 21,1 ± 0,5 0 3 Gause 1 18,8 ± 0,3 22,2 ± 0,7 4 Gause 2 17,3 ± 0,5 20,2 ± 0,6 Hình 2. VVK của 2 chủng xạ khuẩn K4 và HT 28 trong các MTlên men 1. A - 4 2. A4H 3. Gause1 4. Gause 2. Ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng sinh tổng hợp CKS pH của MT không chỉ ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng, phát triển của xạ khuẩn mà còn có ảnh hƣởng sâu sắc đến các hoạt động trao đổi chất, đến hoạt lực của các enzym, vì vậy cũng sẽ có ảnh hƣởng tới quá trình sinh tổng hợp CKS. Để xác định pH của MT thích hợp cho sự sinh tổng hợp CKS, chúng tôi tiến hành lên men xạ khuẩn trong MT có pH khác nhau và xác định HTKS của dịch lên men. Kết quả đƣợc thể hiện trên các bảng 2 và hình 3 cho thấy: pH ban đầu của MT có ảnh hƣởng rất rõ rệt đến sự sinh tổng hợp CKS của xạ khuẩn. Vi Thị Đoan Chính và cs Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 73(11): 115 - 119 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên | 117 HTKS của cả 2 chủng đều biểu hiện mạnh nhất trong MT có pH = 7, giảm chút ít trong MT có pH = 6 và có xu hƣớng giảm mạnh trong các MTcó pH = 5 và MT kiềm. Hình 3. Ảnh hƣởng của pH đầu đến HTKS của chủng K4 và HT 28 Bảng 2. HTKS của chủng K4 và HT 28 trong MT có pH ban đầu khác nhau TT pH ban đầu của MT Hoạt tính kháng sinh (D – d, mm) Chủng K4 Chủng HT 28 1 5 15,0 ± 0,5 13,3 ± 0,6 2 6 25,5 ± 0,2 23,2 ± 0.4 3 7 28,2 ± 0,6 27,5 ± 0,3 4 8 17,2 ± 0,5 14,0 ± 0,7 5 9 9,1 ± 0,4 10,0 ± 0,9 Hình 4. VVK của chủng K4 và HT 28 ở các pH khác nhau Nhƣ vậy,pH của MT = 7 là thích hợp nhất cho sinh tổng hợp CKS của cả 2 chủng xạ khuẩn K4 và HT 28. Dịch lên men trong MT có pH = 7 có VVK lớn nhất (hình 4). Kết quả nghiên cứu này của chúng tôi hoàn toàn phù hợp với đặc điểm sinh học của xạ khuẩn nói chung, đồng thời cũng phù hợp với kết quả của một số tác giả đã công bố trƣớc [2], [3], [5]. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng sinh tổng hợp CKS Để nghiên cứu ảnh hƣởng của nguồn cacbon đến khả năng sinh tổng hợp CKS của 2 chủng xạ khuẩn nghiên cứu, mà với mục đích là lựa chọn đƣợc nguồn cacbon thích hợp, chúng tôi tiến hành lên men xạ khuẩn trong môi trƣờng lên men có bổ sung các nguồn cacbon khác nhau và xác định HTKS của dịch lên men. Kết quả thể hiện trên bảng 3 và hình 5 đã khẳng định: nguồn cacbon có ảnh hƣởng nhiều đến quá trình sinh tổng hợp CKS của 2 chủng nghiên cứu và khả năng đồng hoá các nguồn cacbon của 2 chủng K4 và HT 28 có sự khác nhau. Bảng 3. HTKS của chủng K4 và HT 28 trong MT có các nguồn cacbon khác nhau T T Nguồn cacbon (%) Hoạt tính kháng sinh (D – d, mm) Chủng K4 Chủng HT 28 1 Tinh bột tan 1,0 20,6 ± 0,6 17,6 ± 0,7 2 Glucose 1,5 21,2 ± 0,7 20,0 ± 0,2 3 Lactose 1,5 13,3 ± 0,4 19,3 ± 0,2 4 Saccarose1,5 7,3 ± 0,2 0 5 Maltose 1,5 17,4 ± 0,3 15,4 ± 0,5 6 D-fructose 1,5 13,2 ± 0,5 0 Hình 5. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon đến HTKS của chủng K4 và HT 28 Chủng K4 có khả năng đồng hoá đƣợc cả 6 nguồn cacbon và tất cả các dịch lên men đều có HTKS, nhƣng HTKS biểu hiện mạnh nhất trong MT có 2 nguồn cacbon là glucose và tinh bột tan. Trong khi đó, chủng HT28, HTKS biểu hiện mạnh nhất trong MT có 2 nguồn cacbon là glucose và lactose. Đặc biệt, trong 2 MT có saccarose và D-fructose, dịch lên men của chủng này hoàn toàn không có Vi Thị Đoan Chính và cs Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 73(11): 115 - 119 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên | 118 HTKS, biểu hiện là không có vòng vô khuẩn (hình 6). Nhƣ vậy, glucose là nguồn cacbon thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp CKS của cả 2 chủng K4 và HT 28 cũng nhƣ nhiều chủng xạ khuẩn sinh CKS đã đƣợc nghiên cứu trƣớc đây [2],[3]. Kết quả này của chúng tôi không phải là ngoại lệ Hình 6. VVK của chủng K4 và HT 28 trong MT có nguồn cacbon khác nhau 1. Tinh bột tan; 2. Glucose; 3. Lactose; 4. Saccarose; 5. Maltose; 6. D - Fructose Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh tổng hợp CKS Cũng nhƣ cacbon, nitơ là nguồn dinh dƣỡng không thể thiếu của các VSV nói chung và xạ khuẩn nói riêng. Để nghiên cứu ảnh hƣởng của nguồn nitơ đến khả năng tổng hợp CKS và lựa chọn đƣợc nguồn nitơ thích hợp cho 2 chủng nghiên cứu, chúng tôi tiến hành lên men xạ khuẩn trong môi trƣờng có bổ sung các nguồn nitơ khác nhau và xác định HTKS của dịch lên men. Kết quả thể hiện trên bảng 4 và hình 7 cho thấy: nguồn nitơ có ảnh hƣởng nhiều đến quá trình tổng hợp CKS của 2 chủng nghiên cứu và cả 2 chủng đều có khả năng sử dụng đƣợc nhiều nguồn nitơ khác nhau. Trong 5 nguồn nitơ đƣợc sử dụng trong thí nghiệm, HTKS của mỗi chủng đều không có sự khác nhau nhiều giữa các nguồn nitơ. Bảng 4. HTKS của chủng K4 và HT 28 trong MT có các nguồn nitơ khác nhau TT Nguồn nitơ (%) Hoạt tính kháng sinh (D – d, mm) Chủng K4 Chủng HT 28 1 (NH4)2SO4 0,2 17,1 ± 0,6 18,2 ± 0,3 2 KNO3 0,1 8,0 ± 0,3 17,2 ± 0,4 3 Bột đậu tƣơng 1,0 19,6 ± 0,5 6,7 ± 0,2 4 Cao nấm men 1,0 18,4 ± 0,2 17,7 ± 0,2 5 Pepton 1,0 17,3 ± 0,3 13,7 ± 0,4 Hình 7. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ đến HTKS của 2 chủng K4 và HT 28 Tuy nhiên, với chủng K4, HTKS biểu hiện mạnh hơn trong MTcó nguồn nitơ là bột đậu tƣơng và cao nấm men. Trên các nguồn nitơ còn lại, HTKS của dịch lên men biểu hiện yếu hơn, đặc biệt trên MT muối KNO3 – HTKS rất thấp (hình 8). Hình 8. VVK của 2 chủng K4 và HT 28 trong MT có các nguồn nitơ khác nhau 1. (NH4)2SO4; 2. KNO3; 3. Bột đậu tương; 4. Cao nấm men; 5. Pepton. Kết quả này cũng hoàn toàn dễ hiểu vì bột đậu tƣơng và cao nấm men là những nguồn nitơ hữu cơ, ngoài cung cấp nitơ cho tế bào, có thể còn chứa một số chất cần cho quá trình sinh tổng hợp CKS và chỉ có thể giải thích rõ ràng khi biết rõ các thành phần hoá học của 2 nguồn nitơ này. Trong khi đó, chủng HT28, nguồn nitơ ƣu thế lại thuộc về muối (NH4)2SO4 và cao nấm men, HTKS yếu nhất trong MT bột đậu tƣơng (hình 8). Trong công Vi Thị Đoan Chính và cs Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 73(11): 115 - 119 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên | 119 nghệ sản xuất CKS, đây là một lợi thế. Để kinh tế, có thể thay thế nguồn cao nấm men bằng muối (NH4)2SO4. Tuy nhiên, với các nguồn nitơ vô cơ, nhiều chủng xạ khuẩn khác lại cho HTKS cao hơn trong MT muối NH4NO3 [1] hoặc KNO3 hay NH4Cl [2]. Điều này chỉ có thể giải thích đƣợc khi biết rõ cơ chế hình thành CKS. KẾT LUẬN 1. Môi trƣờng lên men thích hợp cho sinh tổng hợp CKS của chủng xạ khuẩn K4 là A- 4H và chủng HT 28 là Gause 1 2. pH ban đầu của môi trƣờng lên men thích hợp cho sinh tổng hợp CKS của 2 chủng xạ khuẩn K4 và HT 28 là pH = 7 3. Nguồn cacbon thích hợp cho sự sinh tổng hợp CKS của chủng xạ khuẩn K4 là glucose và tinh bột, của chủng HT 28 là glucose và lactose. 4. Nguồn nitơ thích hợp cho sự sinh tổng hợp CKS của chủng xạ khuẩn K4 là bột đậu tƣơng và cao nấm men, của chủng HT 28 là (NH4)2SO4 và cao nấm men. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1].Phạm Kim Dung, Lê Gia Hy, Ngô Đình Bính (1992), “Nghiên cứu sinh tổng hợp Chlotetraxiclin từ chủng Streptomyces aureofaciens KH-30 trong điều kiện nuôi cấy chìm” Tạp chí Sinh học, tập 14, số 4. Tr. 52 – 55. [2]. Bùi Thị Việt Hà (2006), Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật ở Việt Nam. Luận án Tiến sĩ Sinh học. [3]. Lê Gia Hy (1994), Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh đạo ôn và thối cổ rễ phân lập ở Việt Nam. Luận án Tiến sĩ Sinh học. [4] Lê Gia Hy, Phạm Kim Dung, Ngô Đình Bính (1992), “Nghiên cứu khả năng sinh chất kháng sinh chống bệnh đạo ôn của một số chủng xạ khuẩn (Streptomyces) phân lập ở Việt Nam”. Tạp chí Sinh học, Tập 14 số 4, tr. 59 – 63. [5] Lê Gia Hy, Nguyễn Quỳnh Châu, Phạm Kim Dung (1992), “Ảnh hƣởng của Ca và Co lên khả năng sinh tổng hợp clotetraxilin và vitamin B2 bằng phƣơng pháp lên men bề mặt”. Tạp chí Sinh học,tập 14, số 4, Tr. 56 – 58. [6]. Đặng Văn Tiến, Nguyễn Đình Tuấn, Vi Thị Đoan Chính, Ngô Đình Bính (2009), Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh kháng vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây bệnh bạc lá. Báo cáo Hội nghị CNSH toàn quốc năm 2009, Tr. 414 – 419. [7]. Nguyễn Thị Vinh và Cs (2006), Báo cáo hoạt động theo dõi sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh thường gặp ở Việt Nam 6 tháng đầu năm 2006. Chƣơng trình Antibiotic Susceptibity Test Surveilance (ASTS) - Tổ chức phát triển Quốc tế của Thụy Điển (SIDA). SUMMARY THE INFLUENCE OF FERMENTATIVE CONDITIONS ON ANTIBIOTIC BIOSYNTHESIS ABILITY OF TWO STEPTOMYCES STRAINS K4 AND HT 28 ISOLATED IN THAI NGUYEN SOIL Vi Thi Doan Chinh  , Duong Thi Tinh, Trinh Ngoc Hoang College of Sciences – Thai Nguyen University Two streptomyces trains K4 and HT28 isolated from the soil in Thai Nguyen Province have antibiotic actively well, especially, ability of resisting some pathogenous Pseudomonas aeruginosa strains used for this study. We have determined some suitable conditions for antibiotic biosynthesis of these streptomyces trains. A-4H medium with pH = 7 is suitable for K4 strain. The source of cacbon apply for this train are glucose and starch, the source of nitrogenous apply are soya flour and yeast extract. For HT28 strain, the suitable cacbon source are glucose and lactose. Nitrogenous source are (NH4)2SO4 salt and yeast extract. Key words: actinomycetes, fermentative conditions , antibiotic activity, cacbon source, nitrogenuos source Vi Thị Đoan Chính và cs Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 73(11): 115 - 119 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên | 120