Nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học trong lá trầu (Piper betle L.)

Phạm Thế Chính và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 96(08): 69 - 73 69 NGHIÊN CỨU CÁC HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TRONG LÁ TRẦU (PIPER BETLE L.) Phạm Thế Chính1, Phạm Thị Thắm1, Nguyễn Hồng Phong1 1Trường Đại học Khoa học - ĐH Thái Nguyên 2Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐHQG Hà Nội TÓM TẮT Bằng phương pháp chiết theo độ phân cực tăng dần của dung môi, các lớp chất thiên nhiên trong lá trầu không Piper Betle L. đã được phân tách thành bốn lớp chất khác nhau. Lớp chất kém phân cực được chiết bằng n-hexan (cặn H, 4,62%), lớp chất phân cực trung bình được chiết bằng dung môi diclometan (cặn D, 4,19% ), lớp chất phân cực được phân bố vào dung môi chiết etyl axetat (cặn E, 1,80%), lớp chất phân cực cao phân bố vào dung môi chiết metanol-nước (cặn W, 6,03%). Hoạt tính vi sinh vật của các cặn chiết đã được nghiên cứu, trong đó cặn E có hoạt tính mạnh nhất, kháng được hai dòng vi sinh vật S. aurenus và E. coli, cặn chiết D kháng được S. aurenus. Từ cặn chiết D đã phân lập được hai chất tinh khiết là 4-allylpyrocatechol và eugenol, từ cặn chiết E phân lập được một chất tinh khiết 4-allylpyrocatechol. Cấu trúc của các hợp chất phân lập được xác định bằng các phương pháp phổ IR, MS, 1H&C-NMR, DEPT, HSQC, HMBC. Hợp chất 4- allylpyrocatechol đã được nghiên cứu hoạt tính chống oxi hóa với SC50=12,87 µg/ml và kháng mạnh dòng S. aurenus (MIC=50 µg/ml). Từ khóa: Piper, betle, sriboa, eugenol, trầu MỞ ĐẦU* Cây trầu có tên khoa học là Piper betle L. (hay Piper sriboa L.), thuộc họ hồ tiêu (Piperaceae), được trồng ở khắp nơi trong nước ta để lấy lá ăn trầu. Nó còn được trồng tại nhiều nước khác ở châu Á, vùng nhiệt đới như Malaysia, Inđonesia, Philippin... Ngoài việc dùng lá trầu nhai với cau và vôi để ăn trầu và bảo vệ răng miệng, dân gian còn dùng nước lá trầu để sát trùng, chống lở loét, chống viêm nhiễm...[2]. Do vậy nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học trong lá trầu được các nhà khoa học thế giới đặc biệt quan tâm [1,3,4], nhưng trong nước mới có vài công trình nghiên cứu sơ bộ về lá trầu. Chúng tôi chú trọng nghiên cứu các hoạt chất có hoạt tính sinh học theo phương pháp thử sinh học. THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Mẫu thực vật Lá trầu không (Piper betle L.) được thu hái vào tháng 2 năm 2009 tại Hải Dương. Mẫu thực vật được GS. TS Nguyễn Nghĩa Thìn giám định và phân loại. * Tel: 0988 113933, Email: chemistry20069@gmail.com Hóa chất và thiết bị Chất hấp phụ dùng cho sắc kí cột là silica gel (0,040 – 0,063 mm, Merck). Sắc kí lớp mỏng dùng bản mỏng tráng sẵn 60F254 (Merck). Các dung môi chiết và chạy sắc kí đạt loại tinh khiết (PA). Phổ cộng hưởng từ hạt nhân được ghi trên máy Bruker AV ở 500 MHz đối với phổ 1H và 125,7 MHz đối với 13C-NMR. Phổ khối lượng được đo trên máy LC-MSD-Trap-SL và Hewlett Packard HP 5890, Serie II. Phổ IR được đo trên máy Impac 410-Nicolet FT-IR. Chiết phân lớp các lớp chất trong lá trầu 1000 g bột lá trầu khô được ngâm chiết với MeOH khan ở nhiệt độ phòng 3 lần, mỗi lần 2 ngày. Gộp dịch chiết, cất quay ở áp suất thấp ở 400C đến còn 600 ml. Hạ nồng độ MeOH đến 60% bằng nước rồi chiết bằng n-hexan 3 lần, mỗi lần 100 ml. Hạ thấp nồng độ MeOH đến 50% rồi chiết bằng CH2Cl2 3 lần mỗi lần 100 ml. Hạ thấp nồng độ MeOH còn 25% chiết 3 lần mỗi lần 100 ml EtOAc. Làm khô các dịch chiết và loại dung môi ở áp suất thấp thu được các cặn chiết tương ứng như bảng 1. Phạm Thế Chính và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 96(08): 69 - 73 70 Bảng 1. Hiệu suất của các cặn chiết thu được từ lá trầu Cặn chiết n-hexan (H) Diclometan (D) Etylaxetat (E) Metanol-nước (W) Khối lượng (g) 46,2 41,9 18,0 60,3 Hiệu suất (%) 4,62 4,19 1,80 6,03 Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định (VSVKĐ) của các cặn H, M, E, W Phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định: các mẫu thử được thực hiện trên các phiến vi lượng 96 giếng (96-well microtiter plate). Theo phương pháp hiện đại của Vander Bergher và Vlietlinck (1991), và MCKance, L., & Kandel (1996). Môi trường thí nghiệm: Eugon Broth (Difco, Mỹ) cho vi khuẩn, Mycophil (Difco, Mỹ) cho nấm. Mẫu thô có MIC ≤ 200 µg/ml là có hoạt tính. Kết quả chỉ ra ở bảng 2. Bảng 2. Hoạt tính kháng VSVKĐ của các cặn chiết của lá trầu STT Kí hiệu mẫu Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC: µg/ml) Vi khuẩn Gr(-) Vi khuẩn Gr(+) Nấm mốc Nấm men E. Coli P. Aeruginosa B. Subtillis S. Aureus Asp. Niger F. Oxysporum C. Albicans S. Cerevisiae 1 H (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) 2 D (-) (-) (-) 200 (-) (-) (-) (-) 3 E 200 (-) (-) 200 (-) (-) (-) (-) 4 W (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) Phân lập các hợp chất trong cặn D và E bằng sắc ký cột Cho 4 g cặn D lên cột 2,5 x 80 cm, có chứa 120 g silica gel cỡ hạt 40 – 63 µm, rửa cột bằng n-hexan/etyl axetat, 4/1, v/v với tốc độ 25 giọt/ phút, thể tích các phân đoạn 4 ml. Kiểm tra các phân đoạn bằng sắc kí lớp mỏng, thu các phân đoạn chỉ có một vệt chất cùng Rf và cùng sắc phổ, loại dung môi thu chất sạch. Kết quả phân lập được D1 và D2, D1 chiếm 16,25% trọng lượng cặn D, D2 chiếm 45,25% trọng lượng cặn D. Tương tự như trên tiến hành sắc ký cột 4,2 g cặn E, kết quả thu được 1 chất tinh khiết là E1, chiếm 73,81% khối lượng cặn E. D1 là một chất lỏng có 25Dn =1,5401, Rf=0,76 n-hexan/etyl axetat ,4/1, v/v. IR (Film): νmaxcm -1: 3517 (OH), 3083 (CH thơm); 2941, 2849 (CH3,CH2); 1594, 1443 (C=C, thơm); 990 (=CH2). EI-MS: M+=164, m/z (%):164 (100%), 149(38%), 131(22%), 121 (18%), 103 (21%), 91(20%), 77 (23%), 65(10%), 55(22%). 1H-NMR (500MHz, DMSO), δ (ppm): δ 3,25 (2H, d br, J= 4,8 Hz, 2H-1’); 3,72 (3H, s, OCH3); 5,02 (2H, d br, J=7,0 Hz, H-3’); 5,89 (1H, m, H-2’); 6,55 (1H, dd, J = 1,8; 8,0 Hz, H-5); 6,63 (1H, d, J = 1,8 Hz, H-3); 6,81 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-6); 8,80 (1H, s, OH). 13C-NMR (500MHz, DMSO), δ (ppm): δ 38,89 (C-1’); 55,68 (OCH3); 112,37 (C-6); 115,21 (C-3’); 115,83 (C-3); 118,83 (C-5); 132,30 (C-4); 138,05 (C-2’); 145,99 (C-3); 146,48 (C-1). D2 và E1 đều là tinh thể hình kim màu trắng, giống hệt nhau về các hằng số vật lý, sắc ký lớp mỏng và phổ: tnc = 47-480C; Rf=0,60 n- hexan/etyl axetat, 4/1, v/v. MS: M-H=149; IR (Film): νmaxcm -1: 3497 (OH), 2908, 2845 (CH2), 1611, 1522, 1440 (C=C, thơm), 857 (=CH2). 1H-NMR (500MHz, DMSO), δ (ppm): δ 3,21 (2H, d br, J=4,8 Hz, H-1’); 5,03 (2H, d br, J= 7,0 Hz, H-3’); 5,90 (1H, m, H-2’); 6,45 (1H, dd, J = 2,18; 8,0 Hz, H-5); 6,59 (1H, d, J = 2,18 Hz, H-3); 6,70 (1H, d, J = 8,0Hz, H-6); 8,68 (2H, OH). 13C-NMR (500MHz, DMSO), δ (ppm): δ 38,94 (C-1’); 115,06 (C-3’); 115,50 (C-6); 115,84 (C-3); 119,03 (C-5); 130,48 (C-4); 138,31 (C-2’); 143,41 (C-1); 145,09 (C-2). Phạm Thế Chính và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 96(08): 69 - 73 71 Khảo sát hoạt tính sinh học của D2 (E1) Khảo sát hoạt tính kháng VSVKĐ Tiến hành khảo sát hoạt tính kháng VSVKĐ của E1 tương tự như ở mục trên. Kết quả chỉ ra ở bảng 3. Bảng 3. Hoạt tính kháng VSVKĐ của E1 Kí hiệu mẫu Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC: µg/ml) Vi khuẩn Gr(-) Vi khuẩn Gr(+) Nấm mốc Nấm men E. Coli P. Aeruginosa B. Subtillis S. Aureus Asp. Niger F. Oxysporum C. Albicans S. Cerevisiae E1 (-) (-) (-) 50 (-) (-) (-) (-) Khảo sát hoạt tính chống oxi hóa Hoạt tính chống oxi hóa của E1 được tiến hành theo phương pháp của Shela G., Olga, M. B., Elena K., và cộng sự (2003). Dựa trên nguyên tắc 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl (DPPH) có khả năng tạo ra gốc tự do bền trong dung dịch EtOH bão hòa. Khi cho E1 vào hỗn hợp này, nếu chất có khả năng làm trung hòa hoặc bao vây các gốc tự do sẽ làm giảm cường độ hấp thụ ánh sáng của gốc tự do DPPH. Hoạt tính chống oxi hóa được đánh giá thông qua giá trị hấp thụ ánh sáng của dịch thí nghiệm so với đối chứng khi đọc trên máy Elisa ở bước sóng 515 nm. Kết quả chỉ ra ở bảng 4. Bảng 4. Kết quả hoạt tính chống oxi hóa của E1 STT Kí hiệu mẫu Nồng độ mẫu (µg/ml) SC% SC50 (µg/ml) Kết quả 1 Chứng (+) 50 77,7±0,2 15,97 Dương tính 2 Chứng (-) - 0,0±0,0 - Âm tính 3 E1 50 77,32±0,3 12,87 Dương tính KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Chiết phân lớp các hợp chất và khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật của chúng Để nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học trong lá trầu (Piper betle L.) chúng tôi tiến hành chiết tổng các chất trong lá trầu bằng MeOH, sau đó loại bớt dung môi MeOH và chiết phân lớp các chất trong dịch chiết MeOH theo độ phân cực tăng dần của dung môi n-hexan, diclometan, etyl axetat và MeOH tương ứng với độ phân cực tăng dần của dịch bị chiết là 60% MeOH, 50% MeOH, 25% MeOH và cặn cuối cùng là MeOH. Bằng cách này các hợp chất trong lá trầu được chiết thành 4 lớp. Lớp chất không phân cực được chiết bằng n-hexan chiếm 4,62%, lớp chất có độ phân cực trung bình được chiết bằng diclometan chiếm 4,19%, lớp chất có độ phân cực cao hơn được chiết bằng EtOAc chiếm 1,80% và lớp chất có độ phân cực lớn nhất được chiết bằng MeOH chiếm 6,03% trọng lượng lá trầu khô. Rõ ràng hợp chất phân cực mạnh và hợp chất không phân cực trong lá trầu chiếm lượng lớn, chúng gấp rưỡi (10,65:5,99) hợp chất có độ trung bình và khá. Khảo sát hoạt tính kháng 8 loại vi sinh vật kiểm định cho thấy các hợp chất không phân cực và phân cực mạnh không có hoạt tính (xem bảng 2). Trong khi đó các hợp chất có độ phân cực trung bình và trung bình khá có hoạt tính kháng vi sinh vật với 2 loại vi sinh vật kiểm định là E.coli và S.aureus (xem bảng 2). Kết quả này cho thấy nghiên cứu hoạt chất sinh học trong lá trầu chỉ cần nghiên cứu 2 lớp chất này (D và E). Phạm Thế Chính và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 96(08): 69 - 73 72 OH OH CH2 CH CH2 1 2 3 4 5 6 1' 2' 3'3'2' 1' 6 5 4 3 2 1 OH OCH3 CH2 CH CH2 Hình 1 Hình 2 Phân lập và xác định cấu trúc phân tử của các hợp chất trong D và E Để nhanh chóng xác định được hợp chất có hoạt tính sinh học trong một lớp chất, cách nhanh nhất là phân lập các hợp chất trong lớp chất đó sau đó nghiên cứu hoạt tính sinh học của chúng. Bằng sắc kí cột trên silica gel từ cặn chiết có độ phân cực trung bình D chúng tôi phân lập được 2 chất D1 và D2. D1 chiếm 16,25% trọng lượng cặn, D2 chiếm 42,5% trọng lượng cặn D. Hợp chất D2 cũng được phân lập từ cặn E và chiếm tới 73,81% trọng lượng cặn E. Phổ IR và 1H&13C-NMR của D1 cho thấy phân tử của nó có 3 nhóm thế: nhóm phenolic có δH(OH)=8,80 ppm, s (δC=145,99 ppm) và νOH=3517 cm-1; nhóm metoxi có δH(OCH3)=3,72 ppm, 3H, s (δC=55,68 ppm); nhóm propenyl có δH = 3,25 ppm, 2H, d br, J = 4,8 Hz (δC=38,59 ppm), δH = 5,89 ppm, 1H, m (δC=138,05 ppm), δH = 5,02 ppm, 2H, d br, J = 7 Hz (δC=115,21 ppm). Ba nhóm thế này phân bố trong nhân benzen ở các vị trí 1,2 và 4, điều này được khẳng định nhờ δH = 6,63 ppm,1H, d, J = 1,8 Hz; δH = 6,55 ppm, 1H, dd, J = 1,8; 8,0 Hz; δH = 6,81 ppm, 1H, d, J = 8,0 Hz. So sánh phổ khối của D1 với các phổ khối có trong thư viện máy cho thấy phổ khối của D1 trùng lặp với phổ khối của eugenol đến 98%. Các kết quả trên cho phép khẳng định D1 là eugenol (hình 1). So sánh phổ khối của D1 và D2 (E1) cho thấy có sự chênh lệch 14 dvC nghĩa là một nhóm CH2. So sánh 1H&13C-NMR của D1 và E1 chúng ta thấy rõ phân tử D1 mất đi một nhóm metoxi δ=3,72 ppm (3H, s) và thay vào đó là nhóm OH thì cho hợp chất E1. Các kết quả trên khẳng định E1 là 4-allylpyrocatechol (hình 2). Khảo sát hoạt tính sinh học của các thành phần phân lập được Eugenol là hợp chất có nhiều hoạt tính sinh học lý thú; chống nấm, chống đông huyết, đặc biệt là chống sâu răng, có được phẩm eugenat là hỗn hợp của eugenol và kẽm sunfat [3]. 4- allylpyrocatechol đã được phân lập từ lá trầu [4], nhưng hoạt tính sinh học của nó còn ít được quan tâm nghiên cứu. Khảo sát hoạt tính ức chế 8 loại vi sinh vật kiểm định của 4-allylpyrocatechol chúng tôi thấy nó có hoạt tính ức chế mạnh S.aureus là tụ cầu gây viêm nhiễm, IC50 = 50 µg/ml (xem bảng 3). Khảo sát hoạt tính chống oxi hóa của 4-allylpyrocatechol đối với DPPH cho thấy nó là chất chống oxi hóa mạnh có SC% = 77,32% và SC50 = 12,87 µg/ml (xem bảng 4). Các kết quả trên cho thấy phương pháp chiết phân lớp chọn lọc các chất trong lá trầu theo độ phân cực tăng dần của dung môi cùng với độ phân cực tăng dần của dịch bị chiết lá trầu có nhiều ưu điểm. Nó không chỉ cho phép chúng tôi tìm thấy 2 chất có hoạt tính sinh học quí trong lá trầu là eugenol và 4- allylpyrocatechol mà còn cho thấy chúng được chiết tập trung trong hai dung môi là diclometan và etyl axetat. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Đậu Xuân Đức, Hoàng Văn Lựu (2007), “Separation and structure determination of some compounds from Piper betle L.”, Hội nghị khoa học và công nghệ Hóa học hữu cơ lần thứ tư, tr 307-310. Phạm Thế Chính và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 96(08): 69 - 73 73 [2]. Đỗ Tất Lợi (2005), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nxb Y học, tr 118-119. [3]. Hattacharya S., et al (2007), “Healing property of the Piper betle phenol, allylpyrocatechol against indomethacin-induced stomach ulceration and mechanism of action”, Wold Journal of Gastroenterology,13(27), pp 3705-3713. [4]. T. Nalina and Z.H.A. Rahim (2007), The Crude Aqueous Extract of Piper betle L. and its Antibacterial Effect Towards Streptococcus mutans, American Jounal of Biotechnology and Biochemistry, 3(1), p10-15. SUMMARY STUDY BIOACTIVE COMPOUNDS IN THE LEAVES OF PIPER BETLE L. Pham The Chinh1*, Van Ngoc Huong2, Pham Thi Tham1, Nguyen Thi Thanh1, Nguyen Hong Phong1 1College of Science – TNU, 2University of Science –Vietnam National University By increasing polarization of the solvent, the nature products of leaves Piper Betle L. were separated into four different classes, n-hexane (H, 4.62%), dichlomethane (4.19%), ethyl acetate (E, 1.80%), methanol-water (W, 6.03% ).The n-hexane, dichlomethane, ethyl acetate and methanol extracts from leaves of Piper betle L. were tested on the antimicrobial activity. The dichlomethane and ethyl acetate extracts showed significant inhibition against S. Aureus and E. Coli. From these extracts, eugenol and 4-allylpyrocatechol have been isolated. The structure of these compounds have been elucidated on the basis of spectral studies: IR (infrared), MS (mass spectrometry), nuclear magnetic resonance proton and carbon (1H-NMR), and the spetrometric 2D as HSQC and HMBC. Key word: Piper, betle, sriboa, eugenol, antimicrobial * Tel: 0988 113933, Email: chemistry20069@gmail.com