Bài giảng vi sinh vật

Lấy 1 ml dung dịch đất có độ pha loãng 100 lần cho vào ống nghiệm thứ nhất có chứa 9 ml nước cất vô trùng, trộn đều dung dịch bằng cách hút lên rồi thổi xuống 3 – 5 lần ta được độ pha loãng 10-3. - Tiếp tục hút 1 ml ở ống nghiệm thứ nhất cho vào ống nghiệm có chứa 9 ml nước cất vô trùng thứ hai, trộn đều dung dịch như trên ta có độ pha loãng 10-4. - Cứ tiếp tục hút như vậy từ ống nghiệm thứ hai sang ống nghiệm thứ 3, từ ống 3 sang ống 4... ta sẽ có các độ pha loãng 10-5, 10-6... III. Xác định trực tiếp số lượng tế bào vi sinh vật bằng phòng đếm hồng cầu: Phương pháp này thường dùng để đếm số lượng vi sinh vật có kích thước tương đối lớn như nấm men, bào tử nấm mốc, các loại tảo. Người ta thường dùng hai loại phòng đếm hồng cầu là Thomas và Goriaep. Nguyên tắc cấu tạo của phòng đếm: đó là một phiến kính dày hình chữ nhật, chia thành 3 khoảng, khoảng giữa chia thành 2 khoảng nhỏ. Trên mỗi khoảng này có kẻ một lưới đếm, gồm rất nhiều ô vuông . Mỗi ô vuông lại được chia ra thành 16 ô vuông nhỏ , mỗi ô nhỏ có diện tích là 1/400 mm2, và chiều dày là 1/10 mm, như vậy thể tích 1 ô vuông nhỏ là 1/4000 mm3 hay 1/4000.000 ml. Phòng đếm có 1 lá kính dày để đậy. Cách đếm: - Lắc đều ống nghiệm pha loãng mẫu. - Nhỏ 1 giọt dung dịch mẫu vào giữa phòng đếm và đậy lại bằng lá kính, chú ý không để tạo bọt khí. - Di chuyển nhẹ nhàng phòng đếm để dung dịch mẫu tràn đầy các khoang. - Đặt phòng đếm lên bàn kính hiển vi, để yên 3 – 5 phút, sau đó tiến hành đếm số lượng tế bào trong 5 ô lớn chéo nhau (chọn 4 ô ở 4 góc và một ô ở chính giữa). Cách đếm số tế bào trong mỗi ô lớn như sau: mỗi ô nhỏ có 4 cạnh giới hạn, đếm số lượng tế bào nằm trọn trong ô và những tế bào nằm trên 2 cạnh liên tiếp cùng chiều, ví dụ: đếm cạnh bên dưới và cạnh bên phải. Đếm các ô từ trái sang phải, từ hàng trên xuống hàng dưới rồi đổi chiều. Cứ đếm như vậy cho đến ô cuối cùng của 16 ô con. - Số lượng tế bào trong 1 ml mẫu được tính bằng công thức: 4000.103 N = a . . 10n 111 b Trong đó: N là số tế bào trong 1 gam mẫu. a là số lượng tế bào trong 5 ô lớn (80 ô nhỏ). b là số ô nhỏ trong 5 ô lớn (80 ô nhỏ). 103 là số chuyển mm3 thành ml (1000mm3 = 1 ml) 10n là độ pha loãng của mẫu. Chú ý: + Sau khi sử dụng xong phòng đếm phải rửa sạch ngay và lau khô để bảo quản. + Trị số trung bình của số tế bào đếm được trong 1 ô nhỏ phải đảm bảo không lớn hơn 10 tế bào và không nhỏ hơn 2,5 tế bào mới đảm bảo độ chính xác của phương pháp. IV. Xác định gián tiếp số lượng tế bào bằng cách đếm số lượng các khuẩn lạc tạo thành khi nuôi cấy trên môi trường đặc: 1. Nguyên tắc của phương pháp: cấy một thể tích dung dịch mẫu nhất định lên môi trường đặc trưng trong hộp petri, sau đó đếm số khuẩn lạc mọc lên sau một thời gian nuôi cấy nhất định. Khi đó ta coi mỗi khuẩn lạc là kết quả của sự phát triển từ 1 tế bào hay bào tử. 2. Phương pháp cấy mẫu: - Dùng pipet vô trùng lấy 0, 1 ml (tương đương 2 giọt) dung dịch mẫu cho vào mỗi hộp petri. - Dùng que gạt dàn thật đều trên khắp mặt thạch để tách riêng rẽ từng tế bào. Chú ý: ghi vào nắp hộp petri nồng độ pha loãng của dịch cấy và ngày cấy. - Mỗi mẫu cấy 3 nồng độ liên tiếp, mỗi nồng độ cấy ít nhất 3 hộp petri, sau đó lấy kết quả trung bình. - Đặt các hộp petri đã cấy vào tủ ấm có nhiệt độ và thời gian thích hợp cho từng nhóm vi sinh vật. - Sau đó lấy ra và đếm số khuẩn lạc trong từng hộp petri. 3. Cách đếm: - Lấy bút chì kẻ 2 hoặc đường chéo ở đáy hộp petri (tuỳ theo số khuẩn lạc mọc ít hay nhiều) chia hộp thành 4 hoặc 8 phần, đánh dấu thứ tự từng phần từ 1 – 4 hoặc từ 1 – 8. - Đếm số khuẩn lạc từng phần, nhớ đánh dấu các khuẩn lạc đã đếm để tránh trùng lặp. - Số lượng tế bào vi sinh vật trong 1 gam đất được tính theo công thức sau: 1 N = X . . M . K V Trong đó: N là số tế bào vi sinh vật hay số đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU) trong 1 gam đất X là số khuẩn trung bình trong mỗi hộp petri ở cùng độ pha loãng. 112 V là thể tích dung dịch mẫu cấy vào mỗi hộp petri. M là độ pha loãng dùng để cấy. K là hệ số khô kiệt của đất (K = 100/(100 – x), x là độ ẩm của đất) Chú ý: độ pha loãng thích hợp nhất là độ pha loãng mà số khuẩn lạc đếm được trong mỗi hộp petri sau khi nuôi cấy là 50 – 150 khuẩn lạc (đối với vi khuẩn, xạ khuẩn) và 30 – 50 khuẩn lạc đối với nấm. BÀI 1. MỞ ĐẦU I. Đặc điểm chung của vi sinh vật: II. Đối tượng và nhiệm vụ của Vi sinh vật học: III. Vai trò của vi sinh vật trong tự nhiên và trong nền kinh tế quốc dân: IV. Lịch sử phát triển Vi sinh vật học: 1. Giai đoạn trước khi có kính hiển vi (vào khoảng trước thế kỷ XV): 2. Giai đoạn sau khi phát minh ra kính hiển vi: 3. Giai đoạn hình thành khoa học vi sinh vật: 4. Giai đoạn hiện tại: BÀI 2. VIRUT HỌC 113 I. Hình thái, kích thước của virut: II. Cấu trúc của virut: 1. Vỏ capxit (Capside): 2. Lõi axit nucleic: 3. Cấu trúc riêng: a. Cấu trúc bọc ngoài hay vỏ bọc ngoài (Envelop): b. Enzim: c. Tiểu thể bao hàm (Inclusion): III. Quá trình nhân lên của virut trong tế bào cảm thụ: IV. Hiện tượng sinh tan (Lysogenie): V. Hiện tượng cản nhiễm và Interferon: 1. Hiện tượng cản nhiễm (Interference): 2. Interferon: V. Phân loại virut: BÀI 3. HÌNH THÁI VÀ CẤU TẠO CỦA CÁC NHÓM VI SINH VẬT I.Vi khuẩn (Bacteria): 1.Hình thái, kích thước của vi khuẩn: 2.Cấu tạo tế bào vi khuẩn: a. Màng tế bào: b. Nguyên sinh chất (Cytoplasm)/Tế bào chất (Protoplasm): c. Thể nhân: d. Tiên mao (Flagella) và khuẩn mao (tiêm mao – Pili): e. Bào tử/Nha bào (Spore, Endospre): 3. Sinh sản của vi khuẩn: 4. Phân loại vi khuẩn: II.Xạ khuẩn (Actinomycetes): 1. Hình dạng, kích thước và cấu trúc của xạ khuẩn: 2. Sinh sản của xạ khuẩn: 3. Vai trò của xạ khuẩn: 4. Phân loại xạ khuẩn: III.Vi khuẩn lam (Cyanobacteria): IV.Vi khuẩn nguyên thuỷ: 1. Micoplatma (Mycoplasma):. 2. Ricketxi (Ricketsia): 3. Clamidia (Chlamydia): V.Vi nấm (Microfungi): 1.Nấm men (Levure, Yeast): a. Hình dạng, kích thước và cấu tạo tế bào nấm men: 114 b. Sinh sản và các chu kỳ sống của nấm men: c. Vai trò của nấm men: d. Phân loại nấm men: 2.Nấm mốc (Moulds)/ Nấm sợi (Filamentous fungi): a. Hình thái, kích thước và cấu tạo của sợi nấm: b. Sinh sản của nấm mốc: c. Vai trò của nấm mốc: d. Phân loại nấm mốc: BÀI 4. SINH LÝ HỌC VI SINH VẬT I. Sự dinh dưỡng của vi sinh vật: 1.Khái niệm chung: 2.Thành phần hoá học của tế bào vi sinh vật: a. Nước: b. Các chất khoáng: c. Chất hữu cơ: 3. Các kiểu dinh dưỡng ở Vi sinh vật: a. Dinh dưỡng quang năng: b. Dinh dưỡng hoá năng: c. Dinh dưỡng Cacbon: d.Dinh dưỡng Nitơ: e. Dinh dưỡng khoáng: 4. Cơ chế xâm nhập thức ăn qua màng tế bào vi sinh vật: a. Cơ chế khuếch tán thụ động (khuếch tán đơn giản): b. Cơ chế vận chuyển đặc biệt (vận chuyển tích cực, chuyển hoá không gian đặc biệt, khuếch tán xúc tiến): II.Sự trao đổi năng lượng: 1.Khái niệm: 2. Các loại hình hô hấp ở vi sinh vật: a. Hô hấp hiếu khí (chu trình Krebs/ chu trình ATC): b. Hô hấp kỵ khí (lên men): c. Hô hấp kỵ khí đặc biệt (hô hấp nitrat, hô hấp sunphat): III.Sự trao đối chất : 1. Khái niệm chung: 2. Quá trình chuyển hoá các hợp chất không chứa nitơ: a. Chu trình chuyển hoá các bon trong tự nhiên: b. Các quá trình lên men: d. Quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ bền vững: *Quá trình phân giải xenluloza: *Quá trình phân giải tinh bột: 115 *Quá trình phân giải pectin: *Quá trình phân giải lipit và axit béo: e. Quá trình oxy hoá không hoàn toàn: 2.Quá trình chuyển hoá các hợp chất chứa Nitơ: a.Chu trình Nitơ trong tự nhiên: b.Quá trình amôn hoá: c.Quá trình nitrat hoá: d.Quá trình phản nitrat hoá: e. Quá trình cố định Nitơ phân tử: IV. Sự sinh trưởng, phát triển của vi khuẩn: 1. Mẫu lý thuyết về sinh trưởng, phát triển của vi khuẩn: 2. Sinh trưởng, phát triển của vi khuẩn trong điều kiện nuối cấy tĩnh. Đường cong sinh trưởng: 3. Các phương pháp xác định sinh trưởng, phát triển của vi khuẩn: a. Phương pháp xác định số lượng tế bào: b. Phương pháp xác định sinh khối tế bào: BÀI 4. DI TRUYỀN HỌC VI SINH VẬT I. Di truyền của vi sinh vật: II. Biến dị của vi sinh vật: 1. Biến dị phenotip (Thường biến): 2. Biến dị genotip: a. Đột biến: b. Biến dị tổ hợp: III. Sự trao đổi di truyền ở vi khuẩn: 1. Biến nạp (Transformation): 2. Tiếp hợp (Conjugation): 3. Tải nạp (Transduction): IV. Ứng dụng của di truyền vi sinh vật: 1. Phương pháp chọn lọc không dùng tác nhân gây đột biến: 2. Phương pháp chọn lọc dùng tác nhân gây đột biến: BÀI 5. ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN NGOẠI CẢNH ĐẾN VI SINH VẬT VÀ SỰ PHÂN BỐ CỦA VI SINH VẬT TRONG TỰ NHIÊN I. Ảnh hưởng của điều kiện ngoại cảnh đến vi sinh vật: 1. Ảnh hưởng của nhân tố vật lý: a. Độ ẩm: b. Nhiệt độ: c. Không khí: 116 d. Các tia bức xạ: e. Nồng độ các chất hoà tan (áp suất thẩm thấu): 2. Ảnh hưởng của nhân tố hoá học: a. pH môi trường: b. Thế oxy hoá khử: c. Chất khử trùng tiêu độc: d. Các chất hoá trị liệu: e. Chất kháng sinh: 3. Ảnh hưởng của nhân tố sinh học: a. Quan hệ cộng sinh: b. Quan hệ tương hỗ: c. Quan hệ ký sinh: d. Quan hệ đối kháng: II. Sự phân bố của vi sinh vật trong tự nhiên: 1. Sự phân bố của vi sinh vật trong đất: a. Đất là môi trường tự nhiên rất thích hợp cho sự sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật: b. Sự phân bố của vi sinh vật trong đất: c. Tác dụng của vi sinh vật trong đất: 2. Sự phân bố của vi sinh vật trong nước: a. Vi sinh vật trong ao hồ. b. Vi sinh vật trong sông ngòi. c. Vi sinh vật trong nước mạch, nước giếng. d. Vi sinh vật trong nước biển. 3. Sự phân bố của vi sinh vật trong không khí: B. PHẦN THỰC HÀNH ( 14 tiết) 117 Bài 1. PHƯƠNG PHÁP NHUỘM VI SINH VẬT (4 tiết) I. Chuẩn bị phiến kính và lá kính: Người ta sử dụng phiến kính và lá kính để làm các tiêu bản quan sát vi sinh vật. - Phiến kính (lame) thường có kích thước 76 x 26 x 1,1 – 1,4mm. - Lá kính (lamelle) thường có kích thước 14 x 14mm hay 18 x 18mm, chiều dày không quá 0,15 – 0,17mm. Các phiến kính và lá kính cần phải rửa thật sạch. - Đối với loại mới mua thì làm sạch bằng cách đun sôi trong dung dịch NaOH 1% trong 10 phút rồi rửa bằng nước cất. Sau đó rửa lại bằng dung dịch HCl loãng và cuối cùng rửa kỹ bằng nước cất. - Đối với loại đã dùng rồi thì ngâm vào dung dịch rửa loãng sunfobicromat (hỗn hợp 100g H2SO4 đậm đặc, 50g K2Cr2O7, 100ml nước cất) trong 2 giờ. Sau đó rửa bằng nước rồi đun sôi 20 phút trong dung dịchNaHCO3 1% rồi rửa lại thật sạch bằng nước máy, cuối cùng tráng lại bằng nước cất. Các phiến kính và lá kính mỏng đã rửa sạch cần lau thật khô rồi ngâm vào trong các lọ có nút mài đựng cồn 96O. Khi nào sử dụng lấy ra dùng khăn mềm lau khô hoặc hơ qua trên ngon lửa đèn cồn. II. Làm tiêu bản tạm thời: 1. Các đặc điểm của tiêu bản tạm thời: - Thao tác làm tiêu bản đơn giản, tiến hành nhanh. - Quan sát được trạng thái sóng của tế bào như: sự chuyển đọng của tiên mao, sự sinh sản, sự hình thành bào tử... - Tiêu bản loại này chỉ sử dụng một lần rồi bỏ đi. 2. Cách lấy giống vi sinh vật để làm tiêu bản: Muốn làm bất kỳ một loại tieu bản nào về vi sinh vật cũng phải thực hiện các thao tác lấy giống vi sinh vật để làm vết bôi trên tiêu bản. các thao tác đó như sau: - Đốt đèn cồn. - Đặt ống giống có vi sinh vật vào giữa ngón cái và ngón trỏ của bàn tay trái, lòng bàn tay ngửa ra. Ống nghiệm để hơi nghiêng nhưng không được để canh trường vi sinh vật chạm vào nút bông. - Tay phải dùng que cấy và vô trùng bằng cách hơ trên ngọn lửa đèn cồn. Để que cấy thẳng đứng trên ngọn lửa đèn cồn cho đến khi đầu que cấy nóng đỏ rồi từ từ đặt và di chuyển que cấy theo chiều nằm ngang trên ngọn lửa. - Kẹp nút bông vào giữa ngón út và lòng bàn tay phải, xoay nhẹ nút bông 1 vòng và kéo nút ra. Giữ nguyên nút bong như vạy cho đến khi đậy nút vào. - Đốt miệng ống nghiệm trên ngọn đèn cồn. - Khéo léo đưa que cấy (đã nguội) vào ống giống để lấy giống và nhẹ nhàng đưa que cấy ra. + Nếu ống giống là môi trường lỏng chỉ cần nhúng đầu que cấy vào canh trường rồi rút ra. 118 + Nếu ống giống là môi trường đặc thì dùng que cấy lấy một chút sinh khối vi sinh vật trên mặt thạch và hoà đều vào giọt nước cát vô trùng trên phiến kính. Chú ý thao tác hết sức nhẹ nhàng để lấy giống mà không cầy mặt thạch lên. - Rút que cấy ra, đốt miệng ống nghiệm, đậy ống nghiệm nghiệm lại và để ống vào giá. - Đưa giọt canh trường (hoặc sinh khối) vi sinh vật ở đầu que cấy đặt vào giữa phiến kính để làm vết bôi. - Khử trùng lại que cấy trên ngọn đèn cồn rồi cất vào giá. 3. Cách làm tiêu bản giọt ép: - Nhỏ một giọt nước cất lên phiến kính sạch. Dùng que cấy hay pipet lấy một ít tế bào (ở khuẩn lạc) hay một giọt dịch nghiên cứu đặt vào giọt nói trên. Huyền phù vi sinh vật tạo nên trong giọt nước phải không quá đục, vì nếu đục thì rất khó quan sát. - Sau đó lấy một lá kính mỏng đặt lên giọt dịch đó thật cẩn thận sao cho không tạo thành bọt khí. Muốn quan sát lâu thì dùng vazơlin bôi quanh mép lá kính để cho giọt dịch khỏi khô. - Đưa tiêu bản lên quan sát trên kính hiển vi. 4. Cách làm tiêu bản giọt treo: Loại tiêu bản này dùng để theo dõi sự sinh sản, sự hình thành bào tử, khả năng di động và phản ứng của tế bào vi sinh vật với các loại kích thích. - Dùng một loại phiến kính đặc biệt có một chỗ lõm hình tròn ở chính giữa. - Lấy vazơlin bôi quanh phần lõm của phiến kính. - Sau đó lấy pipet nhỏ một giọt dịch nghiên cứu lên chính giữa lá kính rồi lật ngược nhanh xuống để cho giọt dịch nằm ở phía dưới lá kính. Đặt nhẹ nhàng lá kính lên trên chỗ lõm của phiến kính tránh không cho giọt dịch nghiên cứu chạm vào thành hoặc đáy chỗ lõm. Vazơlin giúp cho lá kính đỡ xê dịch và giữ cho giọt dịch khỏi khô. 5. Cách làm tiêu bản tạm thời có nhuộm: Tế bào vi sinh vật rất nhỏ bé và trong suốt nên quan sát ở trạng thái sống không màu sẽ không rõ, rất khó nhận xét được một cách tỷ mỉ. Do đó người ta có thể nhuộm màu vi sinh vật sống để quan sát được dễ dàng hơn. Để vi sinh vật vẫn sống và hoạt động được người ta dùng dung dịch thuốc nhuộm loãng. Đối với tế bào chết thì bắt màu ngay, còn đối với tế bào sống thì vài phút sau mới bắt màu. Cho nên bằng phương pháp này người ta cũng phân biệt được tế bào sống hay tế bào chết. Các loại thuốc nhuộm thường dùng là: - Dung dịch xanh metylen hay fuschin (1: 1000). - Dung dịch đỏ Congo bão hoà 5%. - Dung dịch đỏ trung tính (0,001 – 0,00001%). a. Nguyên tắc: Phương pháp này sử dụng thuốc nhuộm khong hoặc ít độc với vi sinh vật và được pha loãng ở nòng độ đảm bảo cho tế bào vi sinh vật vẫn sống và hoạt động sau khi nhuộm. 119 b. Cách nhuộm: - Cho một giọt thuốc nhuộm lên phiến kính (dùng xanh mêtylen 0,001%). - Dùng que cấy đưa vào đó một ít vi sinh vật lấy từ khuẩn lạc hay 1 giọt dịch nuôi cấy. - Đậy lá kính lên giọt dịch. - Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi ở vật kính (X10) rồi (X40). III. Quan sát vi sinh vật trên tiêu bản cố định. Phương pháp nhuộm đơn, nhuộm Gram: 5. Các đặc điểm của tiêu bản cố định: Quan sát tiêu bản cố định là là một phương pháp phổ biến trong nghiên cứu vi sinh vật vì nó có những ưu điểm sau: - Thao tác tuy phức tạp nhưng tiêu bản có màu sắc đẹp, giữ được lâu. - Không sợ lây nhiễm khi làm việc với vi sinh vật gây bệnh. - Cho phép ta quan sát rõ ràng hình dạng, cấu tạo của tế bào cũng như dễ dàng đếm số lượng tế bào. 6. Cách làm tiêu bản: a. Làm vết bôi: Đặt một giọt nước sạch vào giữa phiến kính, sau đó dùng que cấy đã khử trùng lấy một vòng que cấy vi sinh vật cho vào giọt nước và dàn đều ra. Trường hợp nuôi cấy trên môi trường lỏng thì dùng pipet để lấy dung dịch nghiên cứu. Hơ khô phiến kính đã có vi sinh vật trên ngọn lửa đền cồn hoặc để khô tự nhiên ta được một vết mờ trên phiến kính gọi là vết bôi. Chú ý: - Lượng vi sinh vật lấy vừa phải. - Vết bôi tròn, gọn, thật mỏng. - Các tế bào vi sinh vật được dàn đều, dễ quan sát. b. Cố định vết bôi: - Việc cố định vết bôi nhằm các mục đích sau: + Giết chết vi sinh vật để chúng dễ bắt màu và an toàn khi tiếp xúc (nếu là vi sinh vật gây bệnh). + Gắn chặt vi sinh vào phiến kính để lúc nhuộm không bị rửa trôi. - Các cách cố định: + Cố định bằng nhiệt: dùng kẹp gỗ để kẹp phiến kính, hơ mặt dưới của phiến kính qua lại trên ngọn lửa đèn cồn 2 – 3 lần (chừng vài ba giây), tránh không để tiêu bản quá nóng. + Cố định bằng hoá chất: * Nhúng vết bôi vào cồn 95o khoảng 10 – 15 phút rồi sấy khô. * Ngâm trong axeton 5 phút. * Sấy bằng hơi formol 10 – 15 giây. 7. Phương pháp nhuộm đơn: Nhuộm đơn là dùng 1 loại thuốc nhuộm để nhuộm. Các loại thuốc nhuộm thường dùng để nhuộm đơn là: 120 - Fuchsin kiềm. - Xanh metylen. - Tím gentian. - Đỏ trung tính. Phương pháp nhuộm: đặt tiêu bản đã cố định lên giá rồi nhỏ vài giọt thuốc nhuộm phủ kín vết bôi. Sau 1 – 2 phút, đổ thuóc nhuộm đi và rửa nhẹ bằng nước sạch tới khi nào thấy nước rửa chảy qua vết bôi không còn màu nữa là được. Để tiêu bản khô dần hoặc thấm khô bằng giấy thấm. Khi tiêu bản khô hẳn đem quan sát dưới kính hiển vi. 8. Phương pháp nhuộm Gram: Đây là phương pháp thường được dùng trong thực nghiệm vi sinh vật học. Phương pháp nhuộm kép do nhà bác học người Đan mạch là Christian Gram và những người cộng tác đưa ra năm 1884. Với phương pháp nhuộm này người ta có thể phân biệt vi sinh vật thành 2 nhóm: Gram dương (G+) và Gram âm (G-). Vi sinh vật bắt màu tím sau khi nhuộm gọi là vi sinh vật Gram dương (bao gồm hầu hết xạ khuẩn, trực khuẩn sinh bào tử hiếu khí, nấm mốc, nấm men, cầu khuẩn). Còn những vi sinh vật bắt màu hồng gọi là Gram âm như trực khuẩn sinh bào tử kỵ khí, một số cầu khuẩn như lậu cầu khuẩn, não mô cầu khuẩn... a. Nguyên tắc: Dựa trên khả năng bất màu của tế bào chất và màng tế bào với thuốc nhuộm kết tinh và iot mà hình thành nên hai loại phức chất khác nhau: - Loại phức chất thứ nhất vẫn giữ nguyên màu của thuốc nhuộm nên không bị rửa trôi khi xử lý bằng cồn. Vi sinh vật có phức chất này thuộc loại gram dương. - Loại phức chất thứ hai không giữ được màu của thuốc nhuộm nên mất màu khi bị xử lý bằng cồn và bắt màu của thuốc nhuộm bổ sung. Vi sinh vật có phức chất này thuộc loại gram âm. b. Cách tiến hành: - Làm vết bôi từ ống giống đã nuôi cấy 24 giờ. Để khô và cố định tiêu bản trên ngọn lửa đèn cồn. - Đặt giấy lọc lên trên vét bôi. - Nhuộm tiêu bản bằng thuốc nhuộm tím kết tinh qua giấy lọc trong 1 phút. - Nhỏ dung dịch lugol lên trên vết bôi, giữ 1 phút rồi đổ đi. - Rửa tiêu bản bằng nước rồi tẩy bằng cồn 950 trong 0,5 phút, để nghiêng tiêu bản, nhỏ từ từ từng giọt cồn cho đến khi tan hết màu.. - Rửa tiêu bản bằng nước. - Nhuộm bổ sung Fuchsin lên vết bôi 10 – 30 giây. - Rửa bằng nước, để khô tự nhiên hoặc hơ trên ngọn lửa đèn cồn và đem quan sát dưới kính hiển vi IV. Phần thực hành: 1. Làm tiêu bản vi khuẩn sống bằng phương pháp giọt ép, quan sát dưới kính hiển vi rồi vẽ. 121 2. Làm 4 tiêu bản cố định (vi khuẩn, nấm men, nấm mốc và xạ khuẩn), nhuộm đơn, quan sát dưới kính hiển vi, vẽ hình dạng các nhóm vi sinh vật quan sát được. 3. Nhuộm Gram: trên một phiến kính làm 3 vết bôi: một vết lấy từ vi khuẩn Gram dưuơng ( ví dụ Bacillus mesentericus), vết thứ hai lấy từ vi khuẩn Gram âm (có thể lấy ví khuẩn axetic trên màng dấm hay trên mặt cốc bia bị chua). Giữa 2 vết trên là vết thứ ba lấy từ vi khuẩn nghiên cứu. Ba vết bôi này được nhuộm đồng thời. Nhuộm xong quan sát 3 vết bôi dưới kính hiển vi và kết luận khả năng nhuộm màu theo Gram của vi khuẩn nghiên cứu. 1. Thuốc nhuộm Fuchsin kiềm: (1) Cồn 96o 10 ml Fuchsin kiềm 0,3 gam (2) Phênol (axit phênic) 5 gam Nước cất 95 ml Trộn dung dịch (1) với (2) và pha loãng 5 lần. 2. Thuốc nhuộm xanh mêtylen 0,001%: Xanh mêtylen 0,1 gam Nước cất 1000ml 3. Thuốc nhuộm tím gentian (tím két tinh): (1) Gentian violet 1 gam Cồn 96o 10 ml (2) Phenol 5 gam Nước cất 100 ml Trộn (1) với (2) và lọc trong. Để dịch lọc trong lọ màu. 4. Lugol: KI 2 gam I2 tinh thể 1 gam Nước cất 300 ml Hoà 2 gam KI vào 5 ml nước cát, sau đó thêm 1 gam I2 vào chờ cho I2 tan hết mới thêm nước cất đủ 300 ml. 122 Bài 2. PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG (4 tiết) I. Chuẩn bị dụng cụ thí nghiệm: Trong công tác nghiên cứu vi sinh vật, chuẩn bị dụng cụ thí nghiệm là khâu rất quan trọng và có tính chất quyết định đến kết quả nghiên cứu sau này. Các dụng cụ nghiên cứu vi sinh vật thông thường gồm: hộp petri, pipet, các ống nghiệm, bình tam giác, bình cầu, que gạt thuỷ tinh... Trước hết phải rửa thật sạch các dụng cụ thí nghiệm bằng xà phòng từ 1 – 2 lần, rồi tráng lại bằng nước cất. Để khô tự nhiên hoặc sấy khô. Sau đó tiến hành làm nút bông đối với các dụng cụ có nắp (bình tam giác, ống nghiệm, bình cầu), khi làm nút bông cần chú ý: không làm lỏng quá hay chặt quá, đầu nút bông phải tròn, gọn, không méo mó hoặc xổ bông ra. Tiếp theo dùng giấy báo gói các dụng cụ thí nghiệm lại và đưa vào tủ sấy để khử trùng. Thường sấy ở nhiệt độ 160OC – 170OC trong 1,5 đến 2 giờ. Không nên để nhiệt độ vượt quá 180OC bởi vì nhiệt độ quá cao có thể làm nút bông và giấy báo cháy xém. Khi đạt nhiệt độ và thời gian quy định thì ngắt điện, để nhiệt độ của tủ sấy hạ dần xuống 60OC mới được mở tủ để lấy dụng cụ. Nếu mở tủ khi nhiệt độ chưa hạ xuống thấp dễ gây sự nứt vỡ các dụng cụ thí nghiệm. Các dụng cụ đã khử trùng xong đém cất vào nơi khô ráo sạch sẽ, khi nào cần sử dụng mới bóc bỏ giấy bao gói. II. Phương pháp pha chế môi trường dinh dưỡng: 1. Môi trường dinh dưỡng: Môi trường dinh dưỡng là môi trường có đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết đối với sự phát triển của vi sinh vật, cũng như các yếu tố vật lí và hoá học phù hợp với các hoạt động sống của chúng. Người ta dùng môi trường để phân lập, nhân giống, giữ giống các loại vi sinh vật, đồng thời để nuôi cấy và nghiên cứu các đặc điểm sinh lí, sinh hoá của chúng. Bất kỳ một môi trường dinh dưỡng nào cũng phải có các yếu tố sau đây: - Có đầy đủ chất dinh dưỡng ần thiết. - Có pH thích hợp - Hoàn toàn vô trùng. Tuỳ theo thành phần và nguồn gốc người ta chia môi trường dinh dưỡng làm 3 loại: - Môi trường tự nhiên: chế tạo bằng các chất hữu cơ phức tạp có nguồn gốc tự nhiên. Ví dụ: môi trường sữa, mầu, khoai tây, nước chiết nấm men. 123 Thành phần hoá học của môi trường này không được xác định chính xác do tính chất không ổn định của sản phẩm tự nhiên. - Môi trường tổng hợp là môi trường được pha chế bằng các hoá chất, nên thành phần hoá học của môi trường này được biết một cách cụ thể. - Môi trường bán tổng hợp tức là sử dụng cả hoá chất lẫn chất hữu cơ tự nhiên. Căn cứ vào tính chất lý học, có thể chia môi trường nuôi cấy vi sinh vật thành 3 loại: - Môi trường lỏng (dịch thể): thành phần môi trường này không chứa thạch (agar) và thường được dùng để nghiên cứu các dặc điểm sinh lý, sinh hoá, sinh khối, các sản phẩm trao đổi chất của vi sinh vật. - Môi trường đặc: trong thành phần môi trường này có chứa 1,5 – 2,0% agar hoặc 10 – 20% gelatin và thường dùng để nghiên cứu các đặc diểm hình thái, sinh lý của vi sinh vật, đánh giá các giống thuần khiết, giữ giống, đếm số lượng vi sinh vật. - Môi trường bán lỏng: chứa khoảng 0,35 – 0,7%. - Môi trường xốp: như môi trường kê nấu nhừ, cám, cát thạch anh có thấm dung dịch dinh dưỡng, và thường được ứng dụng trong vi sinh vật học công nghiệp Khi chế tạo môi trường đặc người ta thường dùng agar, đây là một loại polyssaccharit phức tạp thu nhận được từ một số loại tảo biển . Trong nước, agar tạo thành dạng gen và chảy ra ở nhiệt độ 100OC. Còn gelatin là loại protein nhận được khi ninh xương và sụn động vật. Gel tạo thành bởi gelatin bị chảy lỏng ra ở nhiệt độ 23 – 36OC, tức là thấp hơn so với nhiệt độ nuôi cấy bình thường của nhiều vi sinh vật (30 – 37OC), ngoài ra nó còn bị dịch hoá bởi proteaza do một số vi sinh vật tiết vào môi trường. 2. Phương pháp làm môi trường: Việc pha chế môi trường đòi hỏi phải chính xác và cẩn thận. Đây là một trong những khâu quan trọng bậc nhất trong công tác nghiên cứ vi sinh vật. Nếu môi trường không đảm bảo yêu cầu và kém phẩm chất thì sẽ ảnh hưởng đến kết quả nghiên cứu. Các bước chế tạo môi trường dinh dưỡng: b. Pha chế: cân đong thật chính xác từng thành phần môi trường theo đúng trình tự hướng dẫn trong tài liệu. - Đối với môi trường lỏng: cân, đong các chất rồi hoà tan trong nước. - Đối với môi trường đặc: + Cân agar rồi ngâm vào nước, đung cho tan agar. + Cân hoá chất rồi hoà tan trong nước. + Trộn dung dịnh háo chất vào agar đã tan thêm nước vào cho đủ, khuấy và dun cho tan đều. b. Làm trong môi trường: 124 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật cần phải trong, có như thế mới quan sát vi sinh vật được một cách dễ dàng. Có thể làm trong môi trường bằng những cách sau: Lọc qua bông, vải thưa nhiều lớp hay giấy lọc. Dùng lòng trắng trứng gà: cứ một lít môi trường dùng một lòng trắng trứng. Lấy riêng lòng trắng, cho thêm một lượng nước bằng nó rồi đánh tan cho đến khi sủi bọt thì đổ vào môi trường và trộn đều, đun sôi 10 – 15 phút, để lắng rồi lọc. c. Điều chỉnh pH môi trường. Mỗi loài vi sinh vật chỉ phát triển trong một khoảng pH nhất định. Do đó, khi làm môi trường cần điều chỉnh pH cho thích hợp. Người ta thường dùng các dung dịch sau để điều chỉnh pH môi trường: HCl, H2SO4, NaOH, NaHCO3... có nồng độ 0,1N hoặc 10%. d. Phân phối môi trường. Sau khi điều chỉnh pH thì phân phối môi trường vào các bình cầu, ống nghiệm đã chuẩn bị từ trước. Riêng đối với hộp petri nếu không có dụng cụ để giữ khi khử trùng thì khử trùng môi trường xong mới phân phối vào các hộp petri. - Đối với ống nghiệm: nếu dùng môi trường làm thạch nghiêng thì môi trường cần được phân phối chiếm ¼ thể tích của ống nghiệm. Nếu làm thạch đứng thì lượng môi trường cần được phân phối từ ½ - 1/3 thể tích ống nghiệm. - Đối với bình cầu hay bình tam giác, lượng môi trường được phân phối chiếm ½ - 1/3 thể tích của bình. - Các thao tác phân phối phải nhanh, gọn, khéo léo để môi trường không dính lên miệng dụng cụ hoặc nút bông và việc phân phối cần thực hiện xong trước khi môi trường bị đông đặc. e. Khử trùng môi trường. Sau khi pha chế xong thì phải khử trùng môi trường. Có thể kử trùng bằng một trong 3 phương pháp sau: * Hấp bằng hơi nước sôi ở áp suất thường. Đối với các môi trường lỏng không chịu được nhiệt độ cao thì có thể khử trùngở nhiệt độ thấp theo kiểu paxtơ hay kiểu tyndan. - Kiểu Paxtơ: dựa trên cơ sở phần lớn vi sinh vật không bào tử chết ở 60 – 70OC trong khoảng 15 – 30 phút, hoặc 70 – 80OC trong khoảng 5 – 10 phút. Như vậy, theo kiểu này là người ta hấp ở nhiệt độ hơi nước sôi khoảng 30 – 40 phút. Khử trùng bằng phương pháp này chỉ có các tế bào sinh dưỡng bị tiêu diệt, các bào tử vẫn có khả năng sống sót cho nên phương pháp này chỉ dùng để khử trùng sữa, bia và một số thực phẩm khác. - Kiểu Tyndan: Đây là phương pháp khử trùng triệt để ở nhiệt độ thấp bằng cách hấp giai đoạn. Theo phương pháp này người ta hấp 3 -4 lần ở nhiệt độ hơi nước sôi (100OC) mỗi lần 30 – 40 phút. Lần nọ cách lần kia 24 giờ, giữa hai lần hấp lấy môi trường ra đểvào tủ ấm có nhiệt độ thích hợp với nhiệt độ nảy mầm của bào tử vi sinh vật (thường la 28 – 30OC). Sở dĩ làm như vậy vì những bào tử còn sống sót trong lần hấp trước, khi gặp nhiệt độ thích hợp sẽ nảy mầm và chúng sẽ bị tiêu diệt ở lần hấp tiếp sau đó. 125 * Hấp bằng hơi nước sôi ở áp suất cao (dùng nồi áp suất – autoclave). Để khử trùng các loại môi trường (không chứa các loại đường dễ bị phá huỷ) thông htường người ta sử dụng nồi hấp (autoclave) khử trùng ở 1 atm trong thời gian 20 phút. Nếu môi trường đựng trong các bình lớn từ 1 lit trở lên thì khử trùng trong 30 phút. Đối với những môi trường chứa đường dễ bị biến chất ở nhiệt độcao thì có thể khử trùng ở 0,5 – 0,6atm trong 15 phút. Khi khử trùng bằng nồi áp suất cần lưu ý những điểm sau: - Các dụng cụ (bình cầu, bình tam giác, ống nghiệm...) cần có nút bông chặt vừa phải, bên ngoài có bọc bao làm bằng giấy dầu hay giấy báo để tránh hơi nước làm ướt nút bông. - Phải kiểm tra mức nước trong nồi sáp suất đã đủ chưa (xem ở vạch ngang ghi trên ống thuỷ tinh lắp bên ngoài nồi hấp). - Khi đóng các khoá nồi hấp cần vặn từng đôi một đối xứng nhau để nắp không bị vênh, không bị hở. Khi mở cũng phải mở từng đôi đối xứng nhau. - Phải loại hết không khí trong nồi ra mới khoá van thoát hơi nước nước để áp suất trong nồi tăng lên. Có thể loại bỏ hết không khí trong nồi bằng một trong các cách sau: + Đóng khoá thoát hơi nước để tăng áp suất trong nồi lên khoảng 0,5atm rồi mở van thoát hơi để áp suất hơi nước đó tống tất cả không khí lạnh ra khỏi nồi, cho đến khi áp suất trở về không thì đóng van lại và tiếp tục cho tăng áp suất đến mức cần thiết. + Mở van thoát hơi nước ngay từ đầu khi hơi nước bắt đầu thoát ra thành một luồng hơi trắng khá mạnh, đều thì đóng khoá lại và cho tăng áp suất đến mức cần thiết. - Khi khử trùng xong, ngắt điện cho áp suất hạ xuống 0, để nhiệt độ trong nồi giảm hẳn mới được mở nắp lấy môi trường ra. * Lọc qua màng lọc vi khuẩn. Phương pháp này thường dùng đối với một số môi trường không thích hợp với biện pháp khử trùng bằng nhiệt độ cao (môi trường huyết thanh, dung dịch albumin...). h. Làm thạch nghiêng, thạch đứng, đổ thạch vào đĩa petri: - Làm thạch nghiêng: cần tiến hành ngay sau khi khử trùng môi trường vừa kết thúc và môi trường chưa đông đặc: + Đặt ống nghiệm có môi trường lên giá đặt nghiêng nhưng không được để môi trường chạm vào nút bông. + Để yên cho đến khi mặt thạch đông đặc. Yêu cầu mặt thạch phải phẳng, nhẵn, liên tục. - Làm thạch đứng: đặt các ống nghiệm đã có môi trường làm thạch đứng vào giá, để yên cho đến khi môi trường nguội và đông đặc. - Đổ thạch vào đĩa petri: toàn bộ quá trình này phải thực hiện trong tủ cấy vô trùng và gồm các thao tác sau: + Mở bao giấy gói các hộp petri. 126 + Tay phải cầm dụng cụ (bình tam giác) chứa môi trường. + Tay trái lấy nút bông ra và hơ miệng bình trên ngọn đèn cồn. + nghiêng bình và rót nhẹ một chút môi trường vào đĩa petri sau khi tay trái mở hé nắp trên của hộp. + Đậy nắp trên lại, xoay tròn hộp petri để môi trường được phân phối đều trên mặt đĩa. + Để yên cho môi trường nguội và đông đặc. + Lật ngược hộp petri để hơi nước bốc ra và khô dần đi. Chú ý: thao tác đổ thạch phải nhanh và khéo léo để hạn chế sự nhiễm khuẩn. Mặt thạch phải phẳng, nhẵn, có độ dày khoảng 2 mm. thong thường cứ 1 lít môi trường đổ được 22 – 25 hộp. Sau khi đổ môi trường vào hộp, để 1 – 2 ngày để xem môi trường có bị nhiễm hay không rồi mới sử dụng để cấy hay phân lập. i. Bảo quản và kiểm tra môi trường: - Môi trường chưa dùng cần được bảo quản ở chỗ mát, hạn chế tác dụng của ánh sáng, nhiệt độ bảo quản từ 0 – 5oC và không để môi trường bị khô. - Trước khi sử dụng, để kiểm tra độ vô khuẩn của môi trường, người ta thường đặt chúng vào tủ ấm 37oC, trong 48 – 72 giờ. Sau đó lấy ra quan sát, loại bỏ các ống, các hộp có vi sinh vật phát triển và chỉ sử dụng những ống, hộp có môi trường đạt yêu cầu. III. Công thức một số môi trường dinh dưỡng thông dụng: 5. Môi trường nuôi cấy vi khuẩn: b. Môi trường nước thịt – pepton: Nước chiết thịt 1000 ml Peptôn 10 gam NaCl 5 gam Cách chế nước chiết thịt: - Thịt bò tươi lọc sạch gân, mỡ, bạc nhạc, đem xay hoặc thái nhỏ. Cứ 500 gam thịt thêm 1000 ml nước. - Đun nóng từ từ, giữ ở 50oC trong 1 giờ. Sau đó đun sôi 30 phút. - Để nguọi và lắng trong dung dịch vừa đun. - Lọc bằng vải hay giấy lọc. - Phân phối môi trường vào các dụng cụ để khử trùng. b. Môi trường nước mắm – peptôn: Nước mắm 35o đạm 30 ml. Peptôn 10 gam Nước cất bổ sung đến 1000 ml pH = 7, khử trùng 1 atm/30 phút. c. Môi trường thạch – nước thịt – peptôn: Nước thịt 1000 ml Peptôn 10 gam Thạch 20 gam pH = 7, khử trùng 1 atm/30 phút. 127 6. Môi trường nuôi cấy xạ khuẩn: c. Môi trường Gauze 1: Tinh bột tan 20 gam K2HPO4 0,5 gam MgSO4. 7 H2O 0,5 gam KNO3 1,0 gam NaCl 0,5 gam FeSO4 0,1 gam Nước cất 1000 ml pH = 7,2 – 7,4. d. Môi trường tinh bột – đạm sunphát: (NH4)2SO4 1,0 gam K2HPO4 1,0 gam NaCl 1,0 gam MgSO4.7H2O 1,0 gam Tinh bột tan 10 gam Nước máy 1000 ml pH = 7,0. 7. Môi trường nuôi cấy nấm men: d. Môi trường giá đậu – đường: cân 100 gam giá dậu. Thêm 1000 ml nước. Đun sôi 30 phút. Lọc lấy dịch trong. Bổ sung nước cho đủ 1000 ml và thêm 50 gam đường. Nếu làm môi trường đặc thì bổ sung 20 gam thạch. e. Môi trường Sabouraud: Peptôn 10 gam Mantoza/ glucoza 40 gam Nước 1000 ml pH = 5,5 – 6,0. f. Môi trường Hansen: Glucoza/Mantoza hoặc đường kính 50 gam Peptôn 10 gam K2HPO4 3,0 gam MgSO4. 7H2O 2,0 gam Nước 1000 ml. 8. Môi trường nuôi cấy nấm mốc: c. Môi trường Czapec: Saccaroza 30 gam K2HPO4 1,0 gam NaNO3 30 gam MgSO4. 7 H2O 0,5 gam FeSO4 0,01 gam Nước cất 1000 ml 128 pH = 6. Khử trùng 1 atm/30 phút d. Môi trường Martin: Glucoza 10 gam Peptôn 5,0 gam K2HPO4 1,0 gam MgSO4. 7H2O 0,5 gam Rosebengan (1/3000) 100 ml Nước cất 900 ml Streptomixin (1%) 3 ml Bài 3. SỰ CHUYỂN HOÁ CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ CHỨA N VÀ KHÔNG CHỨA N (4 tiết) I. Sự chuyển hoá các hợp chất hữu cơ chứa N: 1. Quá trình amôn hoá: a. Amôn hoá protein: * Các bước tiến hành thí nghiệm: - Tiến hành pha môi trường: 30 gam pepton, 1000ml nước cất. - Đưa môi trường vào ống nghiệm, mỗi ống nghiệm chứa 5 – 7 ml moi trường. - Khử trùng môi trường ở 1 atm trong 15 phút. - Đặt vào thành ống nghiệm và nút bông 1 mảnh giấy quỳ đỏ có thấm nước vô trùng. - Cho vào ống nghiệm một ít dung dịch đất. - Để vào tủ ấm 28 – 30oC trong thời gian 1 tuần. * Phân tích kết quả: - Xác định sự có mặt của NH3: nếu tạo thành NH3 thì giấy quỳ đỏ chuyển thành xanh. - Làm tiêu bản nhuộm đơn, quan sát các vi sinh vật amon hoá: chủ yếu là Bacillus mycoides, Bacillus subtilis, đây là những trực khuẩn Gram dương, ngoài ra còn có mọt số vi khuẩn Gram âm khác. b. Amôn hoá urê: * Các bước tiến hành thí nghiệm: - Pha môi trường: urê 5 gam, K2HPO4 0,5 gam, nước cất 100 ml. - Cho vào bình tam giác 100 ml, mỗi bình 30 ml môi trường. - Khử trùng 1 atm trong 15 phút. - Cho vào bình tam giác một ít đất. - Để 1 mảnh giấy quỳ đỏ treo ở nút bông của bình tam giác. - Nuôi cấy ở 28 – 30oC trong thời gian từ 3 – 4 ngày. * Phân tích kết quả: - Xác định sự có mặt của NH3 bằng cách: + Quan sát sự đổi màu của giấy quỳ từ đỏ sang xanh. 129 + Nhỏ 1 giọt dung dịch nuôi cấy lên bản xứ lõm. Sau đó nhỏ dung dịch Nessler vào, nếu có NH3 thì dung dịch Nessler sẽ chuyển từ màu vàng nhạt sang màu vàng xẫm. - Làm tiêu bản nhuộm đơn để quan sát vi sinh vật amôn hoá ure: gồm đơn cầu khuẩn, song cầu khuẩn hoặc trực khuẩn, chẳng hạn: Micrococcus urea, Planosarcina urea, Bacillus pasteurii... 2. Quá trình nitrat hoá: a. Giai đoạn nitrit hoá: 2NH3 + 3 O2 2HNO2 + 2 H2O + Q * Các bước tiến hành thí nghiệm: - Pha môi trường Vinogratxki 1: (NH4)2SO4 2 gam MgSO4.7H2O 0,5 gam NaCl 2 gam CaCO3/ MgCO3 1 gam K2HPO4 1 gam Nước 1000ml FeSO4 0,4 gam - Phân phối môi trường vào ống nghiệm, mỗi ống nghiệm 3 - 5 ml môi trường. - Khử trùng 1 atm trong 15 phút. - Cho vào ống nghiệm một ít đất. - Nuôi cấy ở 28 – 30oC trong thời gian từ 7 – 10 ngày. * Phân tích kết quả: - Xác định sự có mặt của NO2- : lấy 1 – 2 giọt dung dịch nuôi cấy cho vào bản xứ lõm. Thêm 1 – 2 giọt dung dịch diphenylamin vào. Nếu có mặt NO2- thì dịch thử sẽ có màu trắng hoặc màu xanh nhạt. - Làm tiêu bản nhuộm đơn, soi bằng vật kính dầu để quan sát vi khuẩn nitrit hoá: vi khuẩn nitrit hoá có hình trứng hoặc gần tròn, kích thước nhỏ, đó là Nitrosomonas, Nitrosocystis, Nitrosolobus, Nitrosospira. b. Giai đoạn nitrat hoá: 2HNO2 + O2 2 HNO3 + Q * Các bước tiến hành thí nghiệm: - Pha môi trường Vinogratxki 2: NaNO2 2 gam MgSO4.7H2O 0,3 gam NaCl 0,5 gam Na2CO3 1 gam KH2PO4 0,5 gam Nước 1000ml FeSO4 0,4 gam - Phân phối môi trường vào ống nghiệm, mỗi ống nghiệm 3 - 5 ml môi trường. - Khử trùng 1 atm trong 15 phút. - Cho vào ống nghiệm một ít đất. - Nuôi cấy ở 25 – 30oC trong thời gian từ 5 – 7 ngày. * Phân tích kết quả: 130 - Xác định sự có mặt của NO3- : lấy 1 – 2 giọt dung dịch nuôi cấy cho vào bản xứ lõm. Thêm 1 – 2 giọt dung dịch diphenylamin vào. Nếu có mặt NO3- thì dịch thử sẽ có màu xanh lam. - Làm tiêu bản nhuộm đơn, soi bằng vật kính dầu để quan sát vi khuẩn nitrat hoá: vi khuẩn nitrat hoá có hình que tròn, hình hạt đậu, hình trứng, hình quả lê... kích thước lớn hơn vi khuẩn nitrit hoá, đó là Nitrobacter, Nitrospira, Nitrococcus. 3. Quá trình phản nitrát hoá: * Các bước tiến hành thí nghiệm: - Pha môi trường có thành phần như sau: KNO3 2 gam MgSO4.7H2O 0,3 gam KH2PO4 1 gam Nacitrat 5 gam K2HPO4 1 gam Nước 1000ml - Phân phối môi trường vào ống nghiệm, mỗi ống nghiệm 4 - 5 ml môi trường. - Khử trùng 1 atm trong 15 phút. - Cho vào ống nghiệm một ít đất. - Nuôi cấy ở 30 – 35oC trong thời gian từ 5 – 6 ngày. * Phân tích kết quả: - Xác định sự tạo thành N2: trong quá trình nuôi cấy N2 không ngừng được tạo ra và tạo thành một lớp bọt khí trên bề mặt môi trường. - Làm tiêu bản nhuộm đơn, soi bằng vật kính dầu để quan sát vi khuẩn phản nitrat hoá: vi khuẩn nitrat hoá là những tế bào hình que, Gram âm, thuộc giống Pseudomonas. II. Sự chuyển hoá các hợp chất hữu cơ không chứa N: 3. Lên men rượu: * Các bước tiến hành thí nghiệm: - Pha môi trường có thành phần như sau: glucoza 15 gam MgSO4.7H2O 0,1 gam (NH4)2SO4 1 gam K2HPO4 1 gam Nước 1000ml - Phân phối môi trường vào bình tam giác 100 ml, mỗi bình 20 – 30 ml môi trường. - Khử trùng 1 atm trong 15 phút. - Cho vào bình tam giác một ít men rượu khô. - Nuôi cấy ở 28 – 30oC trong thời gian từ 1 – 2 ngày. * Phân tích kết quả: - Xác định sự có mặt của CO2 trong bình lên men bằng phản ứng với Ba(OH)2: Cho 5 ml dịch lên men vào ống nghiệm, thêm vào 1 ml dung dịch Ba(OH)2 10%. Dùng kẹp gỗ cặp ống nghiệm và đun nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn. Để 131 lắng dung dịch ta sẽ thấy có kết tủa trắng, điều này chứng tỏ trong dung dịch lên men có mặt của CO2: CO2 + Ba(OH)2 BaCO3 + H2O - Xác định sự có mặt của rượu etylic: Cho vào ống nghiệm 1 – 2 ml dịch lên men. Thêm vào đó 2 ml H2SO4 đậm đặc và nhỏ thêm từng giọt dung dịch bicromat kali 1% cho đến khi màu đỏ da cam của thuốc thử này chuyển sang màu xanh lam nhờ tác dụng với rượu theo phương trình sau: 2K2Cr2O7 + 8 H2SO4 + 3 CH3CH2OH 4KCr(SO4)2 + 3CH3COOH + 11H2O - Làm tiêu bản nhuộm đơn, soi bằng vật kính dầu để quan sát nấm men lên men rượu, tế bào có hình bầu dục, chủ yếu thuộc giống Saccharomyces. 2. Lên men latic: * Các bước tiến hành thí nghiệm: - Muối dưa: nguyên liệu có thể là rau cải/ su hào/dưa... Rửa sạch nguyên liệu để loại bớt vi khuẩn lên men axit béo, cắt thành từng miếng nhỏ vừa phải. Cho vào cốc dung tích 250 ml. Cho thêm 4 gam đường, trộn đều, đổ ngập rau bằng dung dịch NaCl 6% để làm co nguyên sinh tế bào, tạo môi trường có nhiều dinh dưỡng cho vi khuẩn dễ lên men. Nén chặt, để 2 – 5 ngày ở 28 – 30 oC. * Phân tích kết quả: - Xác định sự có mặt của axit lactic (phản ứng tạo axetaldehyt): Cho 20 ml dịch lên men (nước dưa muối) vào cốc dung tích 100 ml , sau đó cho vào 2 ml H2SO4 10%, 5 ml KMnO4 5%. Đậy cốc bằng 1 tờ giấy lọc có tẩm AgNO3 trong NH4OH (10 gam AgNO3, cho nước cất tới 100 ml. Thêm từng giọt NH4OH đến khi tan hết cặn. Đựng dung dịch trong lọ màu). Sau đó đặt cốc trên lưới amiant và đem đun đến khi sôi. Quan sát sự chuyển màu của giấy lọc (giấy lọc chuyển sang màu nâu đen) theo phản ứng sau: 2KMnO4 + 3 H2SO4 K2SO4 + 2 MnSO4 + 3 H2O + 5/2 O2 5 CH3CHOHCOOH + 5/2 O2 CH3CHO + 5 CO2 + 5 H2O CH3CHO bốc hơi tác dụng với AgNO3 làm cho giấy lọc chuyển sang màu nâu đen. - Xác định lượng axit lactic tạo thành trong nước dưa muối bằng cách chuẩn độ với NaOH: Lấy 10 ml dịch lên men (nước dưa muối), cho vào bình tam giác 250 ml, thêm vào đó 20 ml nước cất, 1 – 2 giọt dung dịch phenolphtalein. Sau đó chuẩn độ bằng NaOH 0,1N. Tính lượng axit lactic có trong dung dịch lên men như sau: X = 0,009 x V Trong đó: - X là số g axit lactic có trong dịch 10 ml dịch lên men. 132 - V là số ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ. - 0,009 là số gam axit lactic tác dụng hết với 1 ml NaOH 0,1N. - Làm tiêu bản nhuộm đơn, soi bằng vật kính dầu để quan sát các vi khuẩn lên men lactic, chúng gồm các loài sau: + Streptococcus lactis: hình bầu dục, xếp thành từng đôi hay chuỗi ngắn. + Streptococcus cremosis: tế bào hình cầu, xếp thành chuỗi. + Lactobacterium bulgaricum, Lactobacterium lactis... là những trực khuẩn Gram dương. 3.Quá trình phân giải xenluloza hiếu khí: * Các bước tiến hành thí nghiệm: - Pha môi trường Vinogratxki có thành phần như sau: KNO3 2,5 gam MgSO4.7H2O 0,5 gam NaCl 0,5 gam KH2PO4 1 gam FeSO4 0,01 gam Mn2(SO4)3 0,01 gam Nước cất 200ml - Chjo vào ống nghiệm 4 – 5 ml môi trường. - Khử trùng 1 atm trong 15 phút. - Cho vào ống nghiệm 1 ít đất. - Nhúng vào trong ống nghiệm một dải giấy lọc (20 x 1,5 cm) và dùng kẹp sắt kẹp một đầu dải giấy lọc vào miệng ống nghiệm. - Nuôi cấy ở 28 – 30oC trong thời gian từ 7 – 15 ngày. * Phân tích kết quả: - Quan sát ống nghiệm: các vi sinh vật phân giải xenluloza phát triển tiết ra enzim xenlulaza làm cho giấy bị phân huỷ, hoá nhầy, có màu vàng, hồng, lục, chất nhầy có màu sắc đó chính là khuẩn lạc của vi khuẩn. - Làm tiêu bản nhuộm đơn từ các chất nhầy trên bề mặt giấy lọc, quan sát tiêu bản dưới kính hiẻn vi với vật kính dầu, có thể thấy những đại diện sau: + Niêm vi khuẩn thuộc các giống sau: Cytophaga: khi còn non có hình que dài, mảnh, hơi uốn cong, 2 đầu nhọn, khi già tế bào có hình que ngắn, 2 đầu tế bào tròn. Sporocytophaga có hình thái giống Cytophaga nhưng có khả năng tạo thành vi nang xác hình trong hay hình bầu dục. Sorangium: khi tế bào già có dạng que ngắn và tạo thành các vi nang xác (mỗi vi nang xác có chứa 13 – 40 tế bào). + Các vi khuẩn có khả năng phân giải xenluloza mạnh như: Cellvibrio: phẩy khuẩn, có 1 tiên mao trên tế bào. Khuẩn lạc có màu vàng lục. Cellphacicula: tế bào hình que ngắn, ở giữa phình to, hai đầu nhọn. Khuẩn lạc có màu lục. Cellulomonas: trực khuẩn hình que, mỏng. Khuẩn lạc có màu vàng sữa. 133 Bài 4. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH VI SINH VẬT TRONG ĐẤT (2 tiết) Khu hệ vi sinh vật đất có mối quan hệ mật thiết với cây trồng, vì thế việc xác định vi sinh vật trong đất có vai trò rất quan trọng, giúp ta biết được số lượng cũng như thành phần vi sinh vật trong đất. Ttrên cơ sở đó mà có những biện pháp tích cực tạo điều kiện cho những vi sinh vật có ích phát triển và hạn chế sự có mặt của những vi sinh vật có hại. Để xác định vi sinh vật trong đất người ta có thể dùng nhiều phương pháp khác nhau, trong đó có 2 phương pháp dưới đây được dùng nhiều hơn cả: - Phương pháp xác định trực tiếp số lượng tế bào bằng cách đém dưới kính hiển vi nhờ phòng đếm hồng cầu. - Phương pháp xác định gián tiếp số lượng tế bào bằng cách đếm số khuẩn lạc tạo thành khi nuôi cấy trên môi trường đặc. Để xác định số lượng vi sinh vật trong đất phải tiến hành qua các bước sau: I. Lấy mẫu đất: Việc lấy mẫu đất phải đảm bảo các yêu cầu sau: - Lấy mẫu có tính chất dại diện. 134 - Lượng mẫu lấy vừa phải, đủ để phân tích các đặc tínhlý, hoá, sinh học của đất. - Dụng cụ lấy mẫu, chứa mẫu phải vô trùng. - Lấy mẫu xong phải phân tích ngay không được để quá 24 giờ. - Mẫu lấy phải có nhãn ghi ký hiệu mẫu, thời gian lấy mẫu, địa điểm lấy mẫu, thời điểm lấy mẫu, đặc điểm của vùng lấy mẫu (đất đai, cây trồng, thời tiết khí hậu, địa hình...). Mẫu đất lấy về cần phân tích ngay, nếu để qus 24 giờ một số vi khuẩn sẽ chết, hoặc một số bào tử nấm và vi khuẩn có thể nảy nở thêm hoặc vi sinh vật ở không khí xâm nhập vào làm cho thành phần và số lượng vi sinh vật trong đất thay đổi đi. Nếu trường hợp chưa phân tích được ngay thì phải bảo quản trong tủ lạnh có nhiệt độ khoảng 4 – 5oC. II. Pha loãng mẫu: - Chuẩn bị 2 bình tam giác dung tích 250 ml, bình thứ nhất chứa 99 ml nước cất vô trùng, bình thứ hai để không và một số ống nghiệm có chứa 9 ml nước cất vô trùng. - Khử trùng cối, chày sứ bằng cách cho vào một ít cồn và đốt lên, sau đó để nguội. - Cân 1 gam đất cho vào cối sứ đã vô trùng. - Lấy 0,5 – 1 ml nước cát vô trùng ở bình tam giác thứ nhất cho vào cối sứ có đất để làm nhão đất. Dùng chày sứ đã vô trùng nghiền nát trong vòng 5 phút. - Dùng toàn bộ nước ở bình thứ nhất để chuyển hỗn hợp đất đã nghiền nát vào bình tam giác không. - Lắc bình có chứa dung dịch đất trong 5 phút, để yên 30 phút để làm lắng các hạt lớn. Dung dịch đất trong bình tam giác này có độ pha loãng 100 lần (10-2). - Lấy 1 ml dung dịch đất có độ pha loãng 100 lần cho vào ống nghiệm thứ nhất có chứa 9 ml nước cất vô trùng, trộn đều dung dịch bằng cách hút lên rồi thổi xuống 3 – 5 lần ta được độ pha loãng 10-3. - Tiếp tục hút 1 ml ở ống nghiệm thứ nhất cho vào ống nghiệm có chứa 9 ml nước cất vô trùng thứ hai, trộn đều dung dịch như trên ta có độ pha loãng 10-4. - Cứ tiếp tục hút như vậy từ ống nghiệm thứ hai sang ống nghiệm thứ 3, từ ống 3 sang ống 4... ta sẽ có các độ pha loãng 10-5, 10-6... III. Xác định trực tiếp số lượng tế bào vi sinh vật bằng phòng đếm hồng cầu: Phương pháp này thường dùng để đếm số lượng vi sinh vật có kích thước tương đối lớn như nấm men, bào tử nấm mốc, các loại tảo. Người ta thường dùng hai loại phòng đếm hống càu là Thomas và Goriaep. Nguyên tắc cấu tạo của phòng đếm: đó là một phiến kính dày hình chữ nhật, chia thành 3 khoảng, khoảng giữa chia thành 2 khoảng nhỏ. Trên mỗi khoảng này có kẻ một lưới đếm, gồm rất nhiều ô vuông . Mỗi ô vuông lại được chia ra thành 16 ô vuông nhỏ , mỗi ô nhỏ có diện tích là 1/400 mm2, và chiều dày là 1/10 mm, như vậy thể tích 1 ô vuông nhỏ là 1/4000 mm3 hay 1/4000.000 ml. Phòng đếm có 1 lá kính dày để đậy. 135 Cách đếm: - Lắc đều ống nghiệm pha loãng mẫu. - Nhỏ 1 giọt dung dịch mẫu vào giữa phòng đếm và đậy lại bằng phiến kính, chú ý không để tạo bọt khí. - Di chuyển nhẹ nhàng phòng đếm để dung dịch mẫu tràn đầy các khoang. - Đặt phòng đếm lên bàn kính hiển vi, để yên 3 – 5 phút, sau đó tiến hành đếm số lượng tế bào trong 5 ô lớn chéo nhau (chọn 4 ô ở 4 góc và một ô ở chính giữa). Cách đếm số tế bào trong mỗi ô lớn như sau: mỗi ô nhỏ có 4 cạnh giới hạn, đếm số lượng tế bào nằm trọn trong ô và những tế bào nằm trên 2 cạnh liên tiếp cùng chiều, ví dụ: đếm cạnh bên dưới và cạnh bên phải. Đếm các ô từ trái sang phải, từ hàng trên xuống hàng dưới rồi đổi chiều. Cứ đếm như vậy cho đến ô cuối cùng của 16 ô con. - Số lượng tế bào trong 1 ml mẫu được tính bằng công thức: 4000.103 N = a . . 10n b Trong đó: N là số tế bào trong 1 gam mẫu. a là số lượng tế bào trong 5 ô lớn (80 ô nhỏ). b là số ô nhỏ trong 5 ô lớn (80 ô nhỏ). 103 là số chuyển mm3 thành ml (1000mm3 = 1 ml) 10n là độ pha loãng của mẫu. Chú ý: + Sau khi sử dụng xong phòng đếm phải rửa sạch ngay và lau khô để bảo quản. + Trị số trung bình của số tế bào đếm được trong 1 ô nhỏ phải đảm bảo không lớn hơn 10 tế bào và không nhỏ hơn 2,5 tế bào mới đảm bảo độ chính xác của phương pháp. IV. Xác định gián tiếp số lượng tế bào bằng cách đếm số lượng các khuẩn lạc tạo thành khi nuôi cấy trên môi trường đặc: 1. Nguyên tắc của phương pháp: cấy một thể tích dung dịch mẫu nhất định lên môi trường đặc trưng trong hộp petri, sau đó đếm số khuẩn lạc mọc lên sau một thời gian nuôi cấy nhất định. Khi đó ta coi mỗi khuẩn lạc là kết quả của sự phát triển từ 1 tế bào hay bào tử. 2. Phương pháp cấy mẫu: - Dùng pipet vô trùng lấy 0, 1 ml (tương đương 2 giọt) dung dịch mẫu cho vào mỗi hộp petri. - Dùng que gạt dàn thật đều trên khắp mặt thạch để tách riêng rẽ từng tế bào. Chú ý: ghi vào nắp hộp petri nồng độ pha loãng của dịch cấy và ngày cấy. - Mỗi mẫu cấy 3 nồng độ liên tiếp, mỗi nồng độ cấy ít nhất 3 hộp petri, sau đó lấy kết quả trung bình. 136 - Đặt các hộp petri đã cáy vào tủ ấm có nhiệt độ và thời gian thích hợp cho từng nhóm vi sinh vật. - Sau đó lấy ra và đếm số khuẩn lạc trong từng hộp petri. 3. Cách đếm: - Lấy bút chì kẻ 2 hoặc đường chéo ở đáy hộp petri (tuỳ theo số khuẩn lạc mọc ít hay nhiều) chia hộp thành 4 hoặc 8 phần, đánh dấu thứ tự từng phần từ 1 – 4 hoặc từ 1 – 8. - Đếm số khuẩn lạc từng phần, nhớ đánh dấu các khuẩn lạc đã đếm để tránh trùng lặp. - Số lượng tế bào vi sinh vật trong 1 gam đất được tính theo công thức sau: 1 N = X . . M . K V Trong đó: N là số tế bào vi sinh vật hay số đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU) trong 1 gam đất X là số khuẩn trung bình trong mỗi hộp petri ở cùng độ pha loãng. V là thể tích dung dịch mẫu cấy vào mỗi hộp petri. M là độ pha loãng dùng để cấy. K là hệ số khô kiệt của đất (K = 100/(100 – x), x là độ ẩm của đất) Chú ý: độ pha loãng thích hợp nhất là độ pha loãng mà số khuẩn lạc đếm được trong mỗi hộp petri sau khi nuôi cấy là 50 – 150 khuẩn lạc (đối với vi khuẩn, xạ khuẩn) và 30 – 50 khuẩn lạc đối với nấm. 137