Bài giảng Hóa mô miễn dịch

Hạn chế của phương pháp • Đối với một số kháng thể, đòi hỏi quy trình xử lý mô nghiêm nhặt, đặc biệt là thời gian dung dịch cố định bệnh phẩm • Không giải quyết được tất cả các trường hợp • Chi phí tương đối cao so với xét nghiệm GPB thường quy vì phải nhuộm nhiều kháng thể cho một ca

pdf108 trang | Chia sẻ: truongthinh92 | Ngày: 12/08/2016 | Lượt xem: 1209 | Lượt tải: 0download
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Bài giảng Hóa mô miễn dịch, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
PGS. TS. HÖÙA THÒ NGOÏC HAØ HOÙA MOÂ MIEÃN DÒCH Bài giảng chứng chỉ sinh học phân tử Đối tượng: NCS, CKII, CH, CKI, BSNT Mục tiêu • Biết được hóa mô miễn dịch là gì. • Biết được các ứng dụng trong chẩn đoán • Biết được các ứng dụng trong tiên lượng một số bệnh ung thư • Biết được các ứng dụng trong điều trị một số bệnh ung thư • Biết được các điều kiện đánh giá kết quả nhuộm và các hạn chế của phương pháp HOÙA MOÂ MIEÃN DÒCH (IMMUNOHISTOCHEMISTRY ‟ IHC) LAØ GÌ? • Laø phöông phaùp xaùc ñònh vò trí khaùng nguyeân ñaëc hieäu hieän dieän trong moâ hoaëc teá baøo (baøo töông, maøng teá baøo, nhaân) döïa treân phaûn öùng mieãn dòch (khaùng nguyeân – khaùng theå) keát hôïp vôùi hoùa chaát. 1. ÑAÏI CÖÔNG HOÙA MOÂ MIEÃN DÒCH ‟ LÒCH SÖÛ PHAÙT TRIEÅN  1940s: Coons (mieãn dòch huøynh quang) Khaùng nguyeân Khaùng theå Chaát phaùt huyønh quang - moâ ñoâng laïnh, - caàn trang bò kính hieån vi huøynh quang - Keát quaû khoâng löu tröõ ñöôïc laâu HOÙA MOÂ MIEÃN DÒCH ‟ LÒCH SÖÛ PHAÙT TRIEÅN  1974: Taylor et al: xaùc ñònh moät soá khaùng nguyeân trong teá baøo ôû moâ ñaõ ñöôïc xöû lyù thöôøng quy taïi caùc phoøng xeùt nghieäm GPB. - keát quaû löu tröõ ñöôïc laâu - coù theå söû duïng treân caùc khoái neán löu tröõ töø tröôùc - Khoâng caàn KHV huøynh quang  1990s: aùp duïng roäng raõi treân toaøn theá giôùi.  Hieän nay: xeùt nghieäm thöôøng quy ôû caùc phoøng XN GPB Khaùng nguyeân Antigens  töø ngoaøi cô theå: protein hay polysaccharide cuûa vi khuaån, ñoäc toá, virus, flagella, ... Khaùng Nguyeân • töø trong cô theå: KN goàm: - caùc sôïi trung gian (intermediate filaments), • - thuï theå hormon (ER, PR, AR...), • - caùc protein laø saûn phaåm cuûa ñoät bieán gen: c-kit, p53, Her2, EGFR ... Antigen - Epitope: Laø moät phaàn nhoû cuûa khaùng nguyeân, nôi tieáp xuùc vôùi khaùng theå. Moät khaùng nguyeân coù theå coù vaøi epitope. Moãi epitope ñöôïc nhaän bieát bôûi moät khaùng theå rieâng bieät. Caàn boäc loä epitope tröôùc khi cho tieáp xuùc vôùi khaùng theå (trong quy trình nhuoäm HMMD). Khaùng theå: Antibodies Laø caùc protein nhaän bieát vaø keát noái vôùi khaùng nguyeân ñaëc hieäu. Ñöôïc saûn xuaát töø söï ñaùp öùng vôùi bieåu hieän cuûa khaùng nguyeân. Moãi khaùng theå coù ít nhaát hai vò trí keát noái khaùng nguyeân. Moät phaân töû hình chöõ Y vôùi 4 chuoãi protein: 2 chuoãi nheï 2 chuoãi naëng  Vuøng thay ñoåi (Fab): hai phaàn ñaàu cuûa nhaùnh chöõ Y, chöùa vò trí keát noái khaùng nguyeân. Vuøng oån ñònh (vuøng Fc): phaàn goác cuûa chöõ Y, quan troïng vì coù theå keát noái vôùi boå theå hay caùc teá baøo. Caáu truùc cuûa khaùng theå Cấu trúc của kháng thể Khaùng Theå (KT) „ Khaùng theå ña doøng: gaây mieãn dòch ôû ñoäng vaät vôùi khaùng nguyeân ñaëc hieäu. „baát lôïi: (1) chöùa caùc KT khoâng ñaëc hieäu „ (2) coù khuynh höôùng nhuoäm neàn cao. „ Khaùng theå ñôn doøng: saûn xuaát baèng kyõ thuaät lai „ raát tinh khieát chæ phaûn öùng vôùi moät khaùng nguyeân. Nguyeân taéc cuûa kyõ thuaät hoùa moâ mieãn dòch Heä thoáng phaùt hieän Heä thoáng phaùt hieän „ Men + Chaát maøu (DAB : maøu vaøng naâu) „ (EAC : maøu ñoû) CAÙC KYÕ THUAÄT MIEÃN DÒCH MEN • 1. Mieãn dòch men tröïc tieáp: „Khaùng nguyeân (moâ) + khaùng theå thöù nhaát + men Khaùng theå I Khaùng nguyeân (moâ) men „ ñôn giaûn, nhanh, coù tính ñaëc hieäu . ít nhaïy caûm do thieáu heä thoáng phoùng ñaïi daáu hieäu nhaän bieát. CAÙC KYÕ THUAÄT MIEÃN DÒCH MEN • 2. Mieãn dòch men giaùn tieáp „Khaùng nguyeân (moâ) + khaùng theå thöù nhaát + khaùng theå thöù hai coù gaén men ñoàng thôøi khaùng Ig loaøi cuûa khaùng theå thöù nhaát. Khaùng nguîeân (moâ) men Khaùng theå II Khaùng theå I CAÙC KYÕ THUAÄT MIEÃN DÒCH MEN • 3. KT men – choáng men (peroxidase- antiperoxidase : PAP) Khaùng theå I men Khaùng theå II KT III Khaùng nguîeân (moâ) „ ñaëc hieäu vaø nhaïy caûm hôn 2 phöông phaùp treân Khaùng nguyeân Khaùng theå I 4. Caàu noái Biotin – Streptavidin (LSAB) Khaùng theå II Khaùng theå II Biotin Streptavidin Maøu (DAB, AEC) Peroxidase CAÙC KYÕ THUAÄT MIEÃN DÒCH MEN • 4. Caàu noái Biotin – Streptavidin „ tính nhaïy caûm cao vaø ñaëc hieäu cao. . heä thoáng nhaän bieát ñöôïc phoùng ñaïi leân 4 laàn. CAÙC KYÕ THUAÄT MIEÃN DÒCH MEN • 5. Chuỗi dextran . heä thoáng nhaän bieát ñöôïc phoùng ñaïi leân rất nhiều laàn. Ñaùnh giaù keát quaû nhuoäm • AÂM TÍNH KEÁT QUAÛ NHUOÄM DÖÔNG TÍNH (maøu EAC: ñoû) KEÁT QUAÛ NHUOÄM • DÖÔNG TÍNH (DAB: vaøng naâu) Ñaùnh giaù keát quaû nhuoäm • Ñieàu kieän: •- Coù lam chöùng aâm vaø chöùng döông •- Ñoái chieáu vôùi tieâu baûn nhuoäm HE •- Bieát roõ vò trí khaùng nguyeân ôû nhaân, baøo töông hay maøng baøo töông. 2. ÖÙNG DUÏNG CUÛA HMMD 2.1. Chaån ñoaùn 2.2. Tieân löôïng 2.3. Ñieàu trò ÖÙng duïng trong CHAÅN ÑOAÙN 1. Xaùc ñònh nguoàn goác u 3. Xaùc ñònh taùc nhaân nhieãm khuaån 2. Phaân bieät u laønh vaø ung thö • 2.1.1. Xaùc ñònh nguoàn goác u, ñaëc bieät laø ung thö di caên Vì sao caàn ? - U hoác muõi - Sarcom môõ ? - Carcinom tuyeán bieät hoùa keùm ? HE Hình aûnh vi theå khoâng ñaëc hieäu. Coù nhieàu chaån ñoùan treân cuøng tieâu baûn. • 2.1.1. Xaùc ñònh nguoàn goác u, ñaëc bieät laø ung thö di caên -Caùch ñieàu trò khaùc nhau tuøy loïai ung thö. Vì sao caàn ? U chöa roõ nguoàn goác Vimentin EMA LCA Cytokeratin Sarcoâm (+) Carcinoâm (+) (+) Lymphoâm (+) HMB45 S100 NSE Moâ baøo (+) Thaàn kinh (+) U khaùc (-) (-) (-) (-) Melanoma (+) (+) Sarcoâm (Vimentin +) Actin CD 31, CD34, Factor VIII/ Myogenin, MyoD1, Myosin Desmin Sar. Cơ trơn (+) Sar. cô trôn/cô vaân (+) Sar. cô vaân (+) Sar. maïch maùu (+) Carcinom (EMA/CK +) Thyro- globulin PSA CEA AFP Tuyeán giaùp (+) Gan (+) Tuyeán daï daøy, ñaïi traøng... (+) Tuyeán tieàn lieät (+) Teá baøo CK oáng Tuyeán Truï ñôn Gai söøng hoùa Gai khoâng söøng ñaùy Chaån ñoaùn CK5/6 mesothelioma CK7 ++ ++ Oáng vaø tuyeán CK8 ++ ++ aâm tính Ovary, GIT, giaùp, Gan, noäi maïc, TK noäi tieát thaän, chuyeån tieáp,... CK10/13 döông tính CK17 döông CIN, car. teá baøo gai phoåi , CTC... CK18 + + + aâm tính Car. tuyeán, teá baøo ñaùy CK19 + + - + Ñaïi traøng, Buoàng tröùng, chuyeån tieáp, daï daøy, oâng maät, tuïy, Nhuoäm CK Döông tính trong AÂm tính trong CK20 Ñaïi traøng, ovary, chuyeån tieáp, daï daøy, oâng maät, tuïy, Car. vuù, phoåi, noäi maïc, u khoâng cheá nhaày cuûa buoàng tröùng, car. teá baøo nhoû cuûa phoåi Primary Tumor CK7 CK20 • Lung, Breast, Ovary, Thyroid + - • Salivary gland + - • Colon, Merkel-Cell - + • Stomach -/+ + • Pancreas + + • Adrenal, Renal, Hepatic, - - • Prostate - - Melan A HMB-45 Melanoâm aùc Chromogranin, Synaptophysin U Carcinoid, u coù nguoàn goác thaàn kinh noäi tieát NSE Desmin Myogenin Rhabdomyosarcoma CD99 Sarcôm Ewing/PNET CD15 CD30 Lymphôm Hodgkin Calretinin Mesothelioma CK5/6 GastroIntestinal Stromal Tumor (GIST) CD34 Class II CD117 - DOG1 CD1a - Langerhans cells Caùc tröôøng hôïp minh hoïa - U hoác muõi HE Vimentin EMA CK Keát luaän: CHORDOMA - Haïch treân ñoøn + U trung thaát - Lymphoma ? - Carcinom di caên haïch ? - U khaùc ? LCA NSE Chromogranin Keát luaän: U coù nguoàn goác thaàn kinh noäi tieát U Amiñan - Lymphoma ? - Carcinom khoâng bieät hoùa ? HE Keát luaän: Lymphoma LCA CD20 HE U AMIÑAN - Lymphoma ? - Carcinom khoâng bieät hoùa ? HE CK Keát luaän: CARCINOM khoâng bieät hoùa LCA HE Keát luaän: Melanoma HMB45 U Ñaïi traøng HE Haïch goùc haøm P 4 x 5 cm, dính vaøo moâ saâu E HE ÖÙng duïng HMMD trong chaån ñoaùn 2.2.2. Chaån ñoaùn phaân bieät u laønh vaø ung thö: CEA Kappa, lambda / lymphoma ABH, Lewis Ki67 CEA (-): tuyeán bình thöôøng CEA (+): tuyeán ung thö ÖÙng duïng cuûa HMMD trong chaån ñoùan Kappa (+) Lambda (-) Lymphoma ÖÙng duïng HMMD trong chaån ñoùan teá baøo voû thöôïng thaän cytokeratin „vimentin „Bình thöôøng (+) „(-) „Carcinoâm „(-) (+) „U laønh (+) (+) ÖÙng duïng HMMD trong chaån ñoaùn „ Khaùng nguyeân (KN) ABH „bieåu moâ tuyeán ñaïi traøng „bình thöôøng (-) „nieäu maïc „bình thöôøng (+) „ung thö (+) i t ïi tr „ung thö (-) ÖÙng duïng HMMD trong chaån ñoaùn „ KN Lewis (Lex vaø Ley) „nieäu maïc „bình thöôøng (+) i ï „ung thö (-) chaån ñoaùn vaø taàm soaùt carcinom nieäu maïc ÖÙng duïng HMMD trong chaån ñoaùn P63, actin (+): u nhuù trong oáng daãn söõa (-): carcinoâm vuù daïng nhuù ÖÙng duïng HMMD trong chaån ñoaùn U tuyeán nuùm vuù P63 (+) ÖÙng duïng HMMD trong chaån ñoaùn p63 (+) trong tuyeán tieàn lieät bình thöôøng (hình treân, phaûi) PIN cuûa tuyeán tieàn lieät p63 (-) () ÖÙng duïng HMMD trong chaån ñoaùn P63 (-) carcinoâm vuù, tieåu thuøy hyperplastic colloid nodule: galectin-3 âm tính (100×). follicular carcinoma: galectin-3 dương tính mạnh, trong bào tương (400×). papillary thyroid carcinoma: galectin-3 dương tính mạnh, trong bào tương (400×) galectin-3, HBME-1, CK19 Ret oncoprotein LÀNH ÁC Bệnh lý tuyến giáp Sensitivity, specificity, PPV and NPV of all Benign vs. Malignant Thyroid Lesions for each of the IHC markers Markers Sensitivity Specificity Positive Predictive value Negative Predictive value Galactin-3 0.852 0.724 0.630 0.899 Ret oncoprotein 0.833 0.694 0.600 0.883 HBME-1 0.870 0.643 0.573 0.900 CK-19 0.852 0.684 0.597 0.893 Saleh et al. Diagnostic Pathology 2010 5:9 doi:10.1186/1746-1596-5-9 Yuan W et al. Endocr Relat Cancer 2008;15:343-350 malignant pheochromocytoma paraganglioma benign pheochromocytoma negative control ERBB-2 Mesothelial cell Bcl-2 dương tính : follicular lymphomas, Âm tính: normal or hyperplastic germinal centers – Vi khuaån: Helicobacter pylori, Tropheryma whipplei, – Virus: HBV, HCV, HPV, Adenovirus, Parvovirus, Cytomegalovirus, virus Dengue, Virus Epstein-Barr, virus Herpes simplex, HPV, HIV – Nhieãm naám – Protozoa – . 2.1.3. Xaùc ñònh taùc nhaân nhieãm khuaån ÖÙng duïng HMMD trong chaån ñoaùn Helicobacter pylori trong chaát nhaày cuûa daï daøy Tropheryma whipplei trong thöïc baøo cuûa moâ ñeäm ruoät non Teá baøo bò nhieãm Cytomegalovirus Teá baøo nhieãm HHV-8 2. Xaùc ñònh vi di caên 1. Xaùc ñònh vi xaâm nhaäp 4. Ñoät bieán gen p53 3. Hoïat ñoäng phaân baøo (Ki67, PCNA) ÖÙng duïng trong TIEÂN LÖÔÏNG ung thö „ Duøng khaùng theå choáng maøng ñaùy: „ collagen typ IV, laminin 2.2.1. Xaùc ñònh carcinoâm vi xaâm nhaäp ÖÙng duïng cuûa HMMD trong tieân löôïng „coøn nguyeân Moâ laønh tính bò phaù huûy hoaøn toaøn Carcinoâm vi xaâm nhaäp • Laminin: protein chính cuûa maøng ñaùy moâ vuù 4. Xaùc ñònh carcinoâm vi xaâm nhaäp Khoâng coù teá baøo ñaùy -> ung thö „maøng ñaùy + teá baøo cô bieåu moâ khaùng theå choáng actin moâ tuyeán tieàn lieät teá baøo ñaùy: CK troïng löôïng phaân töû cao teá baøo loøng oáng: CK troïng löôïng phaân töû thaáp. ÖÙng duïng cuûa HMMD trong tieân löôïng Xaâm nhaäp maïch lymphoâ: Nhuoäm D2-40 thaáy roõ maïch lymphoâ beân trong coù teá baøo ung thö, deã phaân bieät vôùi artifact do co ruùt moâ ñeäm treân tieâu baûn nhuoäm HE (×200). 2.2.2 Xaùc ñònh carcinoâm di caên “thaàm laëng” (vi di caên) Xeùt nghieäm giaûi phaãu beänh thöôøng quy + khoâng phaùt hieän ñöôïc 8 – 30% ung thö vuù di caên ñeán haïch + khoâng phaùt hieän caùc oå di caên nhoû chæ 3 tb ÖÙng duïng cuûa HMMD trong tieân löôïng Vi di caên haïch, moät ñaùm teá baøo ung thö vôùi ít teá baøo trong haïch khoù phaùt hieän treân tieâu baûn HE, nhöng deã nhaän bieát treân tieâu baûn nhuoäm hoùa moâ mieãn dòch vôùi cytokeratin Pan CK •2.2.3 Hoïat ñoäng phaân baøo (Ki67, PCNA) Ki67: Döông tính: pha G 1 , S, G 2, M Pha G 0 : aâm tính ÖÙng duïng cuûa HMMD trong tieân löôïng PCNA: Döông tính ôû pha S ÖÙng duïng cuûa HMMD trong tieân löôïng  Gen Ki-67 naèm treân nhaùnh daøi cuûa nhieãm saéc theå soá 10 (10q25). PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen), protein ñöôïc tìm thaáy trong nhaân teá baøo trong pha toång hôïp DNA cuûa chu trình teá baøo. Duøng ñeå phaân ñoä moâ hoïc caùc loïai ung thö khaùc nhau Coù giaù trò trong chaån ñoùan vaø tieân löôïng Tyû leä Ki67 vaø PCNA döông tính trong teá baøo u caøng cao, tieân löôïng caøng xaáu ÖÙng duïng cuûa HMMD trong tieân löôïng Caùch tính ñieåm Ki-67, PCNA • Ñònh tính döïa vaøo: – Tæ leä % nhaân teá baøo baét maøu – Ñaäm ñoä baét maøu • Keát luaän: – AÂm tính: baét maøu <20% – Döông tính: baét maøu > 20% AÂm tính Döông tính Vi theå: bieåu hieän cuûa Ki-67, PCNA ÖÙng duïng cuûa HMMD trong tieân löôïng p53 • p53 (protein 53) - moät protein ñeø neùn u (tumor suppressor), ñöôïc maõ hoùa bôûi gen TP53. – raát quan troïng trong sinh vaät ña baøo, – ñieàu hoøa chu trình teá baøo – coù chöùc naêng ñeø neùn u – vaø nhö vaäy seõ traùnh ñöôïc ung thö. – Teân goïi p53 do coù troïng löôïng phaân töû 53 kilodalton. Nhöng theo tính toùan treân amino acid khoái löôïng thöïc söï chæ coù 43.7kDa.. ÖÙng duïng cuûa HMMD trong tieân löôïng • p53: gen ñeø neùn u, ñaûm nhaän nhieàu chöùc naêng, ñaëc bieät laø chaän tieán trình phaân baøo. • Ñoät bieán gen p53: taïo ra nhöõng phaân töû protein khoâng coù chöùc naêng, tích tuï trong nhaân • p53 tích tuï caøng nhieàu tieân löôïng caøng xaáu. Caùch tính ñieåm p53 • Ñònh tính döïa vaøo: – Tæ leä % nhaân teá baøo baét maøu – Ñaäm ñoä baét maøu 0: khoâng hoaëc <10 % baét maøu 1(+): 10% > baét maøu nhaït 2(+): baét maøu trung bình >10% 3(+): baét maøu ñaäm >10% • Keát luaän: AÂm tính: 0 Döông tính: 1(+), 2(+), 3(+) Vi theå: bieåu hieän cuûa p53 p53 (++) p53 (+++) •ÖÙng duïng cuûa HMMD •trong ñieàu trò 1. Hormon lieäu phaùp 2. Lieäu phaùp nhaém truùng ñích 1 Döï ñoaùn ñaùp öùng ñieàu trò vôùi hormon lieäu phaùp Xaùc ñònh thuï theå Estrogen, Progesteron ôû ung thö vuù „ lieân quan ñeán tieân löôïng beänh nhaân „ ñoä moâ hoïc „ giai ñoaïn beänh „ U bieät hoùa cao, grad thaáp: „ ER, PR döông tính „ „ ñaùp öùng toát vôùi hormon lieäu phaùp ÖÙng duïng cuûa HMMD trong ñieàu trò 2. Lieäu phaùp nhaém truùng ñích (targeted therapy) Her 2 +++  Ñieàu trò Herceptin ÖÙng duïng cuûa HMMD trong ñieàu trò CD117 dương tính ÖÙng duïng cuûa HMMD trong ñieàu trò  Ñieàu trò Gleevec GIST CD20 dương tính ÖÙng duïng cuûa HMMD trong ñieàu trò  Ñieàu trò + Rituximab LYMPHOMA Đột biến gen BRAF V600E (+) ÖÙng duïng cuûa HMMD trong ñieàu trò  Ñieàu trò Zelboraf vemurafenib FDA: August 17, 2011 MELANOMA •Caùc phaân töû nhoû Thuoác Ñích phaân töû Ung thö Imatinib mesylate (Gleevec) c-kit* CML, GIST dermatofibrosarcoma protuberans Gefitinib (Iressa) EGFR tyrosine kinase lung and breast cancers Erlotinib (Tarceva) EGFR* lung cancer Bortezomib (Velcade) apoptosis- inducing drug multiple myeloma Tamoxifen ER*, PR * breast cancer *phaùt hieän baèng hoùa moâ mieãn dòch •Ñieàu trò khaùng theå ñôn doøng Thuoác Ñích phaân töû Ung thö Rituximab CD20* non Hodgkin lymphoma Trastuzumab (Herceptin) Her2* (ErbB2) breast cancers Cetuximab (Erbitux) EGFR* colon cancer non-small cell lung cancer Bevacizumab (Avastin) VEGF colon cancer, breast cancer, non-small cell lung cancer, sarcoma *phaùt hieän baèng hoùa moâ mieãn dòch Hạn chế của phương pháp • Đối với một số kháng thể, đòi hỏi quy trình xử lý mô nghiêm nhặt, đặc biệt là thời gian dung dịch cố định bệnh phẩm • Không giải quyết được tất cả các trường hợp • Chi phí tương đối cao so với xét nghiệm GPB thường quy vì phải nhuộm nhiều kháng thể cho một ca KEÁT LUAÄN * Kyõ thuaät hieän ñaïi, khaùch quan * Giuùp xaùc ñònh nguoàn goác moâ, chaån ñoaùn chính xaùc loaïi u,  ñieàu trò toát caùc loaïi ung thö * Giuùp tieân löôïng vaø theo doõi ñieàu trò ung thö

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdfky_thuat_hoa_mo_mien_dich_pgs_ha_16_3_13_hv_5486.pdf
Tài liệu liên quan